TGXAS-百香果组培苗生产技术规程编制说明

团体标准《百香果组培苗生产技术规程》（征求意见稿）编制说明一、项目来源根据《关于下达2021年第十一批团体标准制修订项目计划的通知》（桂标协﹝2021﹞28号）文件精神，由广西壮族自治区农业科学院提出，广西壮族自治区农业科学院生物技术研究所、广西鼎田农业科技有限公司、广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所共同起草的团体标准《百香果组培苗生产技术规程》(项目编号：2021-1104)。二、项目背景及目的意义百香果，又名鸡蛋果、西番莲果，因其果汁能散发出香蕉、草莓、菠萝等多种水果香味而得名，素有“果汁之王”的美誉。百香果原产于美洲，现广泛种植于热带、亚热带地区。近年来随着我国消费者对百香果的认可，鲜食市场、加工市场对百香果的需求量持续攀升，推动着百香果种植面积的不断扩大。百香果自1985年引进我区，发展至今种植面积和产量均跃居全国第一，成为我区特色产业之一。广西地处亚热带地区，种植百香果气候条件优越，自1985年初次引种以来，经过政府引导和自发种植，于2012前后开始大规模发展，至2019年种植面积跃居全国第一，达到30余万亩，种植百香果已成为广西贫困地区农民脱贫致富的有效途径。目前，制约广西百香果产业持续发展的首要问题是百香果病毒病和茎腐病，其中茎腐病可以通过种植抗茎腐病的品种做砧木的嫁接苗来解决；而百香果病毒病由于药剂防治效果差只能通过种植无病毒苗和建立有效的综合防控体系技术来解决。前人研究表明，可感染百香果的病毒近22种，其中对生产危害较大的有6种，包括东亚百香果病毒、百香果斑纹病毒、夜来香病毒、黄瓜花叶病毒、圣诞红卷叶病毒和木瓜卷叶病毒。百香果感染病毒后叶片会出现嵌纹或花斑，影响百香果植株生长，果实呈现萎缩畸形硬化、果腔缩小和果汁减少，造成产量和品质下降，最终导致产量低、质量差、收益减小，严重影响了广西百香果产业的发展。目前，百香果种苗的繁殖方式主要有3种：用种子播种繁殖；用滕蔓扦插繁殖；用接穗嫁接繁殖。其中，种子播种繁殖，浪费果实、生长周期长、用工量大；扦插繁殖，需要大量滕蔓、易传播病害、加快品种退化；嫁接繁殖，种苗质量好，但占地面积大、成苗周期长、种苗价格高。3种繁殖方法均存在占地、耗时、周期长、生长成本高等问题，若操作不当会加快品种退化、种苗带毒、病害增加致使产量降低，这些问题影响和制约了百香果的产量及品质的形成。利用组织培养方法对百香果进行种苗繁育，可以对百香果植株进行脱毒，克服无性繁殖率低、繁殖速度慢的缺点，加上组织培养不受季节和气候等因素的制约，具有节约土地资源，速度快，质量高，技术密集，便于集约化管理和工厂化生产的优点。近几年广西百香果生产技术取得了阶段性研究进展，形成了初步的配套技术，但距离标准化、产业化的要求尚有较大差距，特别是对百香果茎基腐病和病毒病防控问题仍没有突破性进展，至今尚未形成一套行之有效的百香果安全高效栽培技术体系，培育无毒种苗成为解决该问题的重要手段。目前广西各地的育苗以小散户为主，大多数育苗场地条件落后，育苗技术不规范，种苗质量难以保证，种苗携带病毒、病菌和线虫等情况非常普遍。玉林博白县大多数农户自行扦插繁殖苗木，种苗质量参差不齐，挂果后果实偏小，商品果率低，极大地降低了经济效益。桂林灵川县的情况与博白县相似，主要以农户自行育苗为主，种苗质量难以保证。柳州柳江县和百色田阳县的百香果产业也同样面临着种苗问题，因缺乏育苗基地，需从外地引入种苗，不仅增加生产成本还影响种植成活率。现阶段，有关百香果组培苗生产技术还未形成一套标准的防控措施，健康种苗的快速繁育已成为制约广西百香果高产优质生产的关键因素之一。制定团体标准《百香果组培苗生产技术规程》是一种科学管理的有效手段，通过对育苗环境及设施、生产管理、组织培养、移栽和出圃等阶段进行规定，规范指导百香果组培苗的生产，旨在获得健康脱毒的百香果种苗，解决当下脱毒百香果苗短缺问题，弥补当下百香果组培苗生产领域的空白，促进广西百香果产业的绿色可持续发展。三、标准编制过程（一）成立标准编制工作组团体标准《百香果组培苗生产技术规程》项目任务下达后，成立了标准编制工作组，制定了标准编写方案，明确任务职责，确定工作技术路线，开展标准研制工作，具体标准编制工作由广西壮族自治区农业科学院生物技术究所等单位相关人员配合。（二）收集整理文献资料目前国内关于百香果组培苗生产的相关国家标准、行业标准、地方标准具体列出如下：DB45/T2094-2019黄金百香果栽培技术规程DB45/T2306-2021百香果无病毒健康种苗栽培技术规程（三）研讨确定标准主体内容标准编制工作组在对收集的资料进行整理研究后，标准编制工作组召开了标准编制会议，对标准的整体框架进行了研究，并对标准的关键性问题进行了初步探讨。经过研究，标准的主体内容包括术语和定义、外植体选择与处理、初代培养、继代增殖培养、生根培养、组培苗移栽。形成文本草案、征求意见稿2021年5月，标准起草工作小组进行了广泛实地调研工作，查阅了大量的国内外文献资料，对百香果组培苗生产技术进行系统总结，并于广西农业科学院生物所、玉林市、柳州市、桂林市、白色市等地建立百香果生产的种植示范园。经编制组反复讨论，形成了标准的基本构架，对主要内容进行了讨论并对项目的工作进行了部署和安排。在前期工作的基础之上，通过理清逻辑脉络，整合已有的参考资料中有关百香果组培苗生产技术，并结合百香果生产实际要求的基础上，按照简化、统一等原则编制完成团体标准《百香果组培苗生产技术规程》（草案）。2021年6月～2021年9月，编制组再次深入玉林市、柳州市、桂林市、白色市等百香果产区进行分组调研，并向百香果组培苗生产科研单位、企业征求生产技术意见。针对百香果组培苗在栽培过程中出现的不同公司生产组培苗的农艺性状、产量和质量参差不齐等问题，本课题组对外植体选择与处理、组培苗培育、移栽等生产过程进行大量试验，以生根组培苗质量及移栽成活率为评价指标，取得阶段性进展，确立了百香果组培苗生产程序。根据反馈意见及试验成果，标准编制工作组多次召开会议，对标准草案进行反复修改和研究讨论，形成团体标准《百香果组培苗生产技术规程》（征求意见稿）和（征求意见稿）编制说明。四、标准制定原则1、实用性原则本文件是在充分收集相关资料和文献，分析广西百香果组培苗生产特点，在现有国家、行业标准相关组培苗成产要求的基础上，结合多年实践而总结起草的。符合当前百香果栽培的要求，有利于行业的长远发展，具有较强的实用性和可操作性。2、协调性原则本文件编写过程中注意了与广西百香果组培苗生产相关法律法规的协调问题，在内容上与现行法律法规、标准协调一致。3、规范性原则本文件严格按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》的要求和规定编写本标准的内容，保证标准的编写质量。4、前瞻性原则本文件根据当前广西区内百香果生产单位，种苗质量参差不齐，挂果后果实偏小，商品果率低、经济效益差的现状，同时考虑百香果组培苗生产技术的需求，在标准中体现了个别特色性、前瞻性和先进性条款，作为对百香果组培苗生产的指导。五、标准主要章节内容及确定依据团体标准《百香果组培苗生产技术规程》主要内容包括外植体选择与处理、初代培养、继代增殖培养、生根培养、组培苗移栽。1术语和定义变异率：形态、遗传特性显著有别于原品种的变异株数与植株总数的比率。2百香果组培苗生产（1）外植体的选择是组培瓶苗培育的重要步骤，外植体品质的优劣关系到组培瓶苗品质的优劣。在外植体选择时，需要选取植株健壮、无病虫害、新抽生3d～7d的枝条，以确保外植体在培养基上的萌发率和组培苗的品质优良。（2）外植体清洗是百香果组培苗技术体系建立关键的第一步。首先1％～2％的碱性洗涤剂浸泡20min～30min（清洗茎段表面的灰尘和附着物），流水冲洗30min～40min，将枝条剪成3cm～8cm含一个节的小段。（因为百香果品种多为杂交种，如果用种子作为外植体后代会出行性状分离，用茎段繁殖能确保后代的生物学特性和亲本保持一致）（3）外植体灭菌，在超净工作台上，将外植体利用升汞加“Tween-80”表面活性剂灭菌6～8min，无菌水冲洗3～5次，再用无菌纸吸干表面水分，污染率控制在5%以下。（4）培养条件培养室温度20℃～30℃，湿度40％～60％，光照强度2000Lx～3000Lx，每d光照时间10h～12h。不同的百香果品种对温度的要求存在差异，紫果种和黄金百香果适宜温度为24℃～30℃，哥伦比亚热情果等喜冷凉的品种适宜温度为20～24℃。适当增加光照强度及时长有利于百香果组培苗生长，光照太弱、时长过短植株生长缓慢，且易出现玻璃化植株。（5）初代培养初代培养是指直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行培养。因此，较为严格地说是指成功传代之前的培养，此时的细胞保持原有细胞的基本性质，如果是正常细胞，仍然保留二倍体数。接种时应及时清除污染材料，避免污染整个培养瓶，导致失败。（6）继代增殖培养继代增殖培养是组培苗生产的关键步骤，增殖系数大小直接决定生产的成本高低，培养基中植物生长调节剂浓度配比和培养条件对组培苗增殖系数起着决定性的作用。在超净工作台上，切割初代或继代培养诱导的幼芽，切割成含1～2个节的小段，转接至增殖培养基上，每瓶接种5～8段，培养20d～30d。（7）生根培养生根培养是组培瓶苗培育的最后一个环节，也是组培瓶苗培育成功与否的关键步骤，百香果经过壮苗后的芽在不同的培养基的根系大小、根的数量、须根上是否有根毛等指标和生长情况都受培养基中的植物生长调节剂影响。组培生根苗培养时间在25～40d，符合标准后判定合格。3初代培养（1）不同茎段处理：大田茎段、大棚内茎段、茎尖、不同成熟度的茎段、不同茎段长度；（2）不同消毒时间处理：以0.1％HgCl2为消毒剂，设置了4、6、8、10min时间处理。（3）不同初代培养基配方处理经统计，试验过的培养基配方有99种，激素包括：6-BA、NAA、KT、IBA、CPPU、TDZ、IAA、AS、生物素D、GA3；培养基包括：MS、1/2MS、3/2MS、2MS、MS改良；糖25g/L、30g/L，以及添加谷氨酸、活性炭、琼脂或者卡拉胶等。（4）试验效果1）将茎段材料扦插于大棚中用于组培外植体取材，这样可提高外植体洁净度，减少污染及病毒携带。2）目前外植体材料的处理步骤为：从大棚中选取健壮的茎段作为外植体，以带芽的为最佳，剪去叶片，在洗洁精溶液中浸泡15min，流水冲洗30min，在超净工作台上剪成小段后，0.01%HgCl2中浸泡6～8min，无菌水冲洗3～5遍后接入初代培养基。3）接种要求茎段的腋芽基部要与培养基接触，有助于腋芽吸收培养基养分。外植体尽量接长一点，一般在3～8cm，在芽没办法吸收培养基营养之前，长茎段可为其提供更多营养。用250mL的三角瓶作为培养容器，瓶口塞棉塞，包牛皮纸。或者带透气瓶盖的广口瓶。目前三角瓶和广口瓶都有用于材料培养，材料生长效果差异不明显，生长效果依次为三角瓶＞带透气瓶盖广口瓶＞带不透气瓶盖广口瓶。5继代增殖培养基筛选试验经试验多种不同配方后，筛选出10个继代增殖培养基配方进行连续多代观察，同时对比组培苗在不透气广口瓶、透气广口瓶、三角瓶中的生长情况。试验效果：不同品种对激素浓度的要求存在差异，台农1号需6-BA、IBA浓度高于大黄金、小黄金、和砧木黄果，小黄金需6-BA、IBA浓度最低，各品种增殖系数在3～5倍，苗茎段较粗壮，叶片翠绿。继代增殖过程中若激素浓度过高，组培苗会出现叶片卷曲，植株较矮的症状，更严重的会出现玻璃化。6生根培养基筛选采用生长素IAA、NAA、IBA及其中两者的组合开展生根试验，一共做了13个配方。试验效果：各处理的生根率在40-100%，MS+IBA0.5mg/L糖30g/L+琼脂6g/L处理生根率100%。7以‘台农1号’百香果为例，培养基筛选实验（1）初代培养基筛选取台农1号生长健壮枝条，剪去叶片，在2%的洗洁精溶液中浸泡20min，流水冲洗30min，将枝条剪成6-8的小段，腋芽位于茎段中部，在超净工作台上用0.1%HgCl2浸泡6min，无菌水冲洗4次。在超净工作台上切去茎段切口处0.3-1cm左右，将茎段接种在初代培养基，调节培养基PH至5.8-6.0，每个三角瓶内接种一个茎段，接种20d时，统计腋芽长度。以MS为基础培养基，蔗糖30g/L、琼脂6g/L。从表1可知，MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.1mg/L+谷氨酸50mg/L培养基配方茎段的腋芽生长速度最快。重复试验得出：小黄金百香果适宜的初代培养基为：MS+6-BA0.5mg/L+IBA0.1mg/L+谷氨酸50mg/L。大黄金百香果适宜的初代培养基为：MS+6-BA2.0mg/L+IBA0.5mg/L+谷氨酸50mg/L。表1‘台农1号’百香果初代培养基筛选6-BA（mg/L）IBA（mg/L）谷氨酸（mg/L）腋芽长度（cm）1.00303.511.00.1504.521.00.201.961.00.3201.772.00.1303.822.00.2202.43（2）继代增殖培养基筛选将台农1号初代培养组培茎段转入不同的继代培养基中，30d后统计芽增值倍数及植株生长情况。以MS为基础培养基，谷氨酸20mg/L，蔗糖30g/L、琼脂6g/L。由表2可知，MS+6-BA0.5mg/L+IBA0.2mg/L+谷氨酸20mg/L培养基配方组培苗增值倍数较高，且植株生长情况较好。经重复试验得出：小黄金百香果适宜的继代增殖培养基为：MS+6-BA0.1mg/L+IBA0.05mg/L+谷氨酸20mg/L。大黄金百香果适宜的继代增殖培养基为：MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.5mg/L+谷氨酸20mg/L。表2‘台农1号’百香果继代培养基筛选6-BA（mg/L）IBA（mg/L）芽增殖倍数植株生长情况株高较高，生长势中株高较高，生长势强1.00.24.2株高中下，生长势弱株高中等，生长势中株高中下，生长势中1.00.33.5株高较矮，生长势弱（3）生根培养基筛选将‘台农1号’组培苗转入不同的生根培养基，40d后统计生根数、根长植株生长情况。表3‘台农1号’百香果生根培养基筛选编号处理主根数平均根长（cm）植株生长情况S1IBA0.5mg/L3.23.4根细长、米白色，植株健壮，侧根较多S2IAA0.5mg/L2.63.0根细长、米白色，植株健壮，侧根少S3NAA0.5mg/L6.11.9根短粗，米白色，植株健壮，侧根少S4IAA1.0mg/L7.83.5根细长、米白色，植株健壮，侧根少S5IBA1.0mg/L8.22.8根细长、米白色，植株健壮，侧根较多8生根苗移栽移栽方法：从容器中取出组培苗，用清水洗去根部培养基，移栽至装满椰糠的托盘中，移栽后淋一次1000倍噁霉灵，之后隔10d淋一次上述溶液。30d后，植株长至5cm～7cm，将小苗移栽至盛有珍珠岩：育苗基质比例为1：5的8cm×8cm的营养杯中，每个营养杯种植1株，移栽后淋一次1000倍恶霉灵。将生根苗分为有根、无根在不不同季节进行移栽。春季移栽成活率最高。春季移栽成活率见表4。表4百香果组培生根苗移栽成活情况品种有根苗总数存活数有根苗移栽成活率（%）无根苗总数存活数无根苗移栽成活率（%）小黄金433172.099777.78台农302686.6713538.46砧