DB34T 2071-2014 杂交玉米及亲本真实性鉴定DNA分析方法

DB34DB34/T2071—2014杂交玉米及亲本真实性鉴定DNA分析方法IdentificationofgenuinenessofhybridcornanditsparentsusingDNAanalysismethod安徽省质量技术监督局发布I1GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样GB/T3543.4农作物种子检验规程发芽GB/T6682分析实验室用水规格和试验5.1仅使用分析纯试剂和符合GB/T6682溶解于800mL水中，用盐酸（HCl）调pH至8.0，加水定容至1000mL。在103.4kPa（121℃)条）：），5.150.5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液（EDTA-Na2pH8.0称取185.16十六烷基三甲基溴化铵提取液（CTAB81.7g氯化钠和20苯氰（XyleneCyanoleFF）、2mL36.2台式高速冷冻离心机：最大离心力≥10,000g，温控范围最-10℃~40℃。分别从受检样品和标准样品中随机抽取5粒种子或单株，根据实际情况从以下两种方法中选择任移入2.0mL离心管；每管加入700µL65℃预热的CTAB提取液后离心15min后，吸取上清液至一新离心管，再加入等体积预冷的异丙醇，颠倒离心管数次，在-20℃放置30min；4℃,12,000rpm离心10min，弃上清；加入70％乙醇，旋转离心管数次，弃去乙4MgCl2Tag酶PCR模板-*-*-*-*PCR产物采用6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（见附录B）或毛品中具相同带型的个体所占比例，若在该位点具有相按7.5的方法分别统计受检样品和标准样品——疑似差异位点数与差异位点数之和≤1，判定为近似或极近似品种。5phi056ACTTGCTTGCCTGCCGTTACphi011GCACACACACAGGACGACAGTbnlg125GGGACAAAAGAAGAAGCAGAGGAAATGGGACAGAGACAGACumc1551CACCGGAACACCTTCTTACAGTTTCGAAACCTTCTCGTGATGAGCumc2105ACATACATAGGCTCCCTTTTTCCGTCCCGTGACACTCTCTTTCTCTphi053CTGCCTCTCAGATTCAGAGATTGACAACCCAACGTACTCCGGCAGphi072ACCGTGCATGATTAATTTCTCCAGCCTTGACAGCGCGCAAATGGATTGAACTbnlg2162umc1705ATCTCACGTACGGTAATGCAGACACATGACCTGATAAACCCTCCphi085AGCAGAACGGCAAGGGCTACTTTTGGCACACCACGACGAbnlg107GCAACTAGAAGTAGATGGCTTGTTATCAACAACAAGTGGCTGGCTAGGGTGmmc0241TATATCCGTGCATTTACGTTTCATCGCTTGTCTGTCGAphi034TAGCGACAGGATGGCCTCTTCTphi328175bnlg2235ATCCGGAGACACATTCTTGGphi080umc2084ATCGCGACGAGTTAATTCAAACATTACGATGTCTTCAGTGTGACAC6phi065AGGGACAAATACGTGGAGACACAGCGATCTGCACAAAGTGGAGTumc1380CTGCTGATGTCTGGAAGAACCCTAGCATCATGCCAGCAGGTTTTumc1196CGTGCTACTACTGCTACAAAGTCGTTCGTGTCTTCCGAAACTbnlg1007ATGTGCTGTGCCTGCCTCphi308707phi96100AGGAGGACCCCAACTCCTGTTGCACGAGCCATCGTATbnlg1520ACAGCTGCGTAGCTTCTTCCumc2101CCCGGCTAGAGCTATAAAGCAACTAGCTAGTTTGGTGCGTGGTGbnlg197phi074CCCAATTGCAACAACAATCCTGTGGCTCAGTGATGGCAGAAAbnlg2291phi113CACAACACATCCAGTGACCAGAumc1153CAGCATCTATAGCTTGCTTGCATGGGTTTTGTTTGTTTGTTTGTphi126GAGCTTGCATATTTCTTGTGGAphi031GCAACAGGTTACATGAGCTGACCCAGCGTGCTGTTCCAGTAGTTphi112TGCCCTGCAGGTTCACATTGAGGAGTACGCTTGGATGCTCTTCumc1125CGTCCGACATCTTGCTTTTCTATTTTACTTCTCAGCGGTAGATCbnlg2181bnlg162ACTAGCAGCAGTAAAACCTAATAAAGGGACAAGTAGCTAGCAGTCATTTGCAGT7bnlg244GATGCTACTACTGGTCTAGTCCAGACTCCTCCACTCATCAGCCTTGAumc1277TTTGAGAACGGAAGCAAGTACTACCAACCAACCACTCCCTTTTTAGphi062着丝点(10.04)ATGCCATGCGTTCGCTCTGTATCumc1061AGCAGGAGTACCCATGAAAGTCCTATCACAGCACGAAGCGATAGA8玻璃板处理：取清洗干净的长短玻璃板，用去离子水冲洗干净后晾干，用无水乙醇分别擦洗两遍，晾干；在长板涂0.5mL亲和硅烷工作液，短板（带凹槽）涂0.5mL玻璃板组装：待玻璃板彻底干燥后使用0.4mm均厚的垫片组装凝胶胶膜夹层，注意垫片与玻璃灌胶：在60mL6％PAGE胶中加入40μLTEMED和400μL10％的过硫酸铵溶液，混匀后立即待胶凝固后，将玻璃板安装到电泳槽上，在正极槽和负极槽中分别加入1×TBE用移液器吹吸加样槽，清除气泡和杂质，将梳齿朝内插入梳子形成加样孔。每孔加样5μL恒功率电泳至指示带（二甲苯氰）到达胶板的中部，电泳结束，关闭电将胶板浸入固定液，置于摇床上摇动固定5mi9将胶板移入染色液，摇动染色5min将胶板移入ddH2O中摇动45s，弃去ddH等体积混合不同荧光标记扩增产物，混匀后从混合液中吸取1L加入到DNA板孔中。板中各孔分别加入0.1L分子量内标和8.9L去离子甲酰胺。将样品在PCR仪上95℃打开DNA分析仪，检查仪器工作状态。更换缓冲液，灌胶。将装有样品的微孔板置放于样品架基创建电泳板，在电泳板信息文件中输入样品板编号、各板孔对应的样品编号、电DB34/T2071—2014phi080如图D.2(上),为荧光引物phi011在标准对照和受检样品各单株都扩增出224bp的电泳谱带如图D.2(下),为荧光引物bnlg125在标准对照各单株中扩增出310bp的谱带(箭头所示),在受检样品各单株中扩增出280bp的谱带(箭头所示标准标准对照受检样品图D.2标准对照和受检样品间的毛细管电泳D.3非纯位点的判读如图D.3(上),引物bnlg053在标准对照的全部20个单株中仅扩增出1种带型，受检样品除了扩增出与标准对照相同的带型外，还扩增出新的带型，其中具与标准对照相同的带型的8个单株(箭头所示),占受检样品20各单株的个体比例>20%,因此，该位点记为疑似相同位点。如图D.3(下),引物umc2105在标