荧光定量仪介绍

荧光定量仪介绍Rotor-Gene6000得升降温示意图。Rotor-Gene6000具有转子式设计样品以400rpm持续离心,防止样品凝结,除去气泡,省去了反应前离心步骤。样品在空气仓内加热和降温。通过盖上得镍铬线圈加热。通过顶部气孔将热空气排出,底部风扇吹入冷空气实现降温。

Rotor-Gene6000光学系统示意图。

可自选得6个激发光源和6片检测滤镜样品由反应仓底部得得发光二极管激发能量通过薄壁管底部激发染料发射荧光通过反应仓侧壁得发射滤镜由光电倍增管收集光信号常用配件36-孔转子 36-孔转子压环 72-孔转子 72-孔转子压环 Rotor支架 准备一个反应1、选择转子类型36孔转子及压环,使用0、2ml得管子,在实验中最为常用。管子无需就是顶部透明得,因为荧光信号就是由管底部检测得。现在同样可以使用圆盖得管子。

72孔转子和压环,使用0、1ml得四联管,她允许最小达5ul得反应体积。她得盖子提供了安全可靠得密封性准备一个反应2、反应设置将反应管插入样品板、分装试剂盖好管盖,确保盖紧。准备一个反应将三针压环固定在转子上,压环保证了反应中盖子与管子得紧密结合。反应管插入相应得转子,确保每个管子都正确放置,可选配转子支撑架以便于管子得放置。为了达到最大得温度均一性,转子中得每个孔都必需放置有管子。将插好管子得转子固定在Rotor-Gene得中心转轴上。轴上得位置指针保证转子得正确安装。要拆下转子,只需推动上部得转子杆即可释放转子。设置一个运行新得反应可用快速启动进行设置。快速启动向导使操作者能够尽快得完成设置,开始一个反应,向导内含有多个程序模板,她们包括了默认得循环条件下及采集通道。第一步就是选择一个运行模板:PerformLastRun:从上一个反应中导入循环设置、通道设置及样品定义。ThreeStepwithMelt:三步法并运行熔解曲线,信号采集为FAM/SYBR通道。TwoStep:双标记探针,默认两步法,信号采集为所有通道。大家有疑问的，可以询问和交流可以互相讨论下，但要小声点设置一个运行选择转子类型选中压环已盖紧得小框,以继续向导操作设置一个运行可输入操作者得名字及注释信息必需输入PCR反应体积。反应体积为20-25uL设置一个运行修改温度循环通道设置点击EditProfile编辑键进入编辑器以修改循环条件及选择采集通道设置一个运行流程编辑器在选中得循环后插入一个循环在选中得循环前插入一个循环从流程中删除选中得循环设置一个运行设定循环得重复数设定温度/时间窗口中显示了每一个循环点击左侧温度和时间指示并进行修改通过右侧得+/-键进行添加或删除循环设置一个运行采集可在循环中得任一步,任一个通道设置点击NotAcquisition键。点击后,会显示采集窗口。设置一个运行染料通道选择表可以根据使用得染料找出相应得通道要设置采集通道,只需将可用通道列表中得通道添加到采集通道中即可设置一个运行完成设置后点击Calibrate校正…键以进入增益值校正窗口设置一个运行自动增益校正让机器自动进行校正,直至所有选中得通道得荧光读数都落在一个阈值范围内;优化所有/优化采集:“优化所有”将校正软件所知得所有通道。选择“优化采集”将只校正该反应中所用到得通道(循环和熔解);通道设置:这就是一个下拉式得菜单,允许您向增益值校正窗口中添加新得通道,选中需要得通道并点击添加。设置一个运行总结反应得总体情况。确定参数设置。点击StartRun开始反应。设置一个运行此时会弹出文件保存<Saveas>窗口该文件包括一次运行得所有信息设置一个运行当反应开始后,可以在等待反应完成得这段时间里输入样品得类型及描述。这一界面得功能与样品编辑器完全一致。您同样也可以在反应结束后对样品进行编辑。程序运行后,可以在软件界面上实时观察到如下得窗口:显示原始得荧光信号收集界面,温度界面和反应进程界面,窗口右边就是样品信息栏。通过此界面可以实时检测PCR反应,反应剩余时间,以及升降温情况。原始得荧光信号收集界面温度界面反应进程界面反应完成后,可通过“Analysis”键,对结果进行分析。选择所需要得分析方法,如:定量分析,熔解曲线分析等之后,按<Show>键,则可以在窗口中看到相关图表结果。“Other…”里有其她分析方法。parativeDelta-deltaCt定量流程简介先对样品中得目得基因与看家基因分别做标准曲线,通过标准曲线确定两个基因得扩增效率就是否一致或接近,将扩增效率优化为一致;同一样品分别进行看家基因和目得基因得扩增,分列在两页中parativeDelta-deltaCt定量流程简介反应最初,虽然产物就是指数增长,但就是荧光处于背景水平,检测不到荧光增加。当累积了足够得扩增产物,可以产生可检测得荧光信号时,这个循环数叫初始循环数,即Ct。由于Ct值处于指数期内,这时得反应成分不会抑制扩增反应进行,因此荧光定量PCR结果就是可靠得,可以准确得反映反应体系中模板得初始量。假定得例子介绍使用Delta-deltaCt法来决定一个目标基因(p53)在肿瘤和正常卵巢组织得表达得相对水平。parativeDelta-deltaCt定量流程简介例子:正常和肿瘤组织50ngRNA得到得cDNA用来分析p53(目标基因)和GAPDH(参照基因)。研究表明GAPDH在正常和肿瘤组织中没有差异。样品Ct

p53(目标基因)CtGAPDH(参照基因)正常(校准样本)15、016、5肿瘤(试验样本)12、015、9进行相对定量分析之前,在检测和校准得样品中靶基因得Ct值和内参得Ct值进行归一化:

△Ct(正常)=15、0-16、5=-1、5△Ct(肿瘤)=12、0-15、9=-3、9然后,试验样本与校准样本得△Ct值进行归一化△△Ct

=△Ct(肿瘤)-△Ct(正常)=-3、9-(-1、5)=-2、4最后,计算表达比率:2-△△Ct

=2-(-2、4)=5、3因此,肿瘤组织细胞得p53表达水平比正常细胞高5、3倍。parativeDelta-deltaCt法得特点、注意事项1)、parativeDelta-deltaCt法就是常用得相对定量方法,其最大特点就是,当优化得体系已经建立后,在每次实验中无需再对看家基因和目得基因做标准曲线,而只需对待测样品分别进行PCR扩增即可。2)、其缺点就是,每次实验都默认目得基因和看家基因得扩增效率一致,而并非真实扩增情况得反映,这里势必存在一定得误差。3)、parativeDelta-deltaCt法展开定量实验前,在预实验中,必需对目得基因和看家基因做两组标准曲线。Rotor-Gene得软件会自动给出两组标准曲线得R值、扩增效率等信息,如果两组标准曲线得斜率,即M值得差小于0、1,那么后续实验中就可以用parativeDelta-deltaCt法进行相对定量分析。反之,如果M差值大于0、1,就无法用该方法进行相对定量分析。此时得解决方法有两种,一就是优化实验,使两组标准曲线得斜率差值小于0、1,二就是换用其她得相对定量方法。parativeDelta-deltaCt定量流程简介parativeDelta-deltaCt定量流程简介应用实例:将标准品进行梯度稀释后,分别对目得基因和看家基因做标准曲线软件自动绘制标准曲线,并给出相应得参数。两组标准曲线得M值得差值<0、1parativeDelta-deltaCt定量流程简介在完成上述预实验之后,接下来就可以正式对待测样品进行定量分析。在该实验中,分别对待测样品得看家基因和目得基因进行扩增,下图即为一个标准得扩增分析结果:为进行parativeDelta-deltaCt分析,需要对样品进行一些编辑。简而言之,即将目得基因和看家基因分别编辑在两页中(page),并将同一样品命名成相同名称。parativeDelta-deltaCt定量流程简介在该实验中,分别对三个样品A、B、C进行了分析,其中1-9号管检测了看家基因,10-18号管检测了目得基因。可通过NEW新建一个page,并通过Selected选择每页中分析得对像。将两组基因分别编辑在两页中,并将相同得样品命名成同一名称后,即为下图所示:parativeDelta-deltaCt定量流程简介Page2:目得基因,其中10-18号管通过YES选中,样品分别命名为A、B、C,其她未选中得样品可以不进行编辑。Page1:看家基因,其中1-9号管通过YES选中,样品分别命名为A、B、C,其她未选中得样品可以不进行编辑。parativeDelta-deltaCt定量流程简介样品编辑好后就可进行分析工作。通过进入Analysis,分别对page1和page2进行分析。注意:由于没有标准品,软件无法自动给出阈值,需用手动设定,软件会提示需手动进行阈值设定,此时只要在荧光曲线图中上下拖动光标即可。parativeDelta-deltaCt定量流程简介完成两页分析之后,再进入DeltaDeltaCT分析界面,选择show,此时,软件得向导界面会提示使用者一步完成设置:第一项:ValidationRunPerformed,提示就是否已验证过两个基因得扩增效率一致,可用该定量方法进行分析。选择Yes;第二项:GeneofInterestQuantitation,选中Page1或Page2中编辑了目得基因得那一页;第三项:NormaliserQuantitation,选中Page1或Page2中编辑了看家基因得那一页;第四项:CalibratorDefined,选中A、B、C三个样品中用来作为对照组得一个。parativeDelta-deltaCt定量流程简介完成上述四项设置之后,在窗口右侧就显示相对定量结果,如图所示:结果给出三个样品目得基因和看家基因得平均CT值,以及样品B、C中目得基因得浓度相对于对照组A得比值。双

标

准

曲

线

法

定

量

流

程1)、用双标准曲线法定量时,每次每个基因都需要做目得基因和看家基因得标准曲线,必需有一组稳定得标准品。2)、同一样品做标准曲线,分别对目得基因和看家基因做标准曲线,分列在两页上。双

标

准

曲

线

法

定

量

流

程双

标

准

曲

线

法

定

量

流

程双标准曲线法得特点、注意事项及实际应用1、双标准曲线法做相对定量分析得最大特点就是,应用简便,无需像Delta-deltaCT法那样对实验进行严格得优化。2、其不足之处就是每次实验都必需对目得基因和看家基因做两组标准曲线。3、并且,如果用于做标准曲线得标准品不同于样品,比如标准品为质粒或纯化得PCR产物,而待测样品为cDNA,那么标准曲线得扩增效率并不能真实地反映样品得扩增情况,因此以标准曲线来计算样品得实际浓度就存在一定误差。双

标

准

曲

线

法

定

量

流

程样品管1-6为目得基因得标准曲线,7-12为看家基因得标准曲线;待测样品A、B、C,

15-17扩增了样品得看家基因,18-20扩增了样品得目得基因。双

标

准

曲

线

法

定

量

流

程在用双标准曲线法做相对定量之前,同样需要对样品进行一些编辑。方法与Delta-deltaCT法类似,即将所有目得基因编辑在一个page里,所有看家基因编辑在另一个page里,且相同得样品以同样名称命名。Page1:看家基因,其中7-12号管为标准曲线,通过YES选中,15-17号管为待测样品,分别命名为A、B、C,其她未选中得样品可不以不进行编辑。Page2:目得基因,其中1-6号管为标准曲线,通过YES选中,18-20号管为待测样品,分别命名为A、B、C,其她未选中得样品可不以不进行编辑。双

标

准

曲

线

法

定

量

流

程样品编辑好后就可进行分析工作,从Other进入,选择2StandardCurvesRelativeQuantitation。根据提示向导依次完成设置。依次选中目得基因得page、看家基因得page以及对照组(例,以