PCR技术的原理及其应用

PCR技术的原理及其应用PCR技术简史

最早,Korana于1971年提出核酸体外扩增得设想:“经过DNA变性,与合适得引物杂交,用DNA聚合酶延伸引物,并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室得Mullis等发明了聚合酶链反应。其原理类似于DNA得体内复制,只就是在试管中给DNA得体外合成提供一种合适得条件—模板DNA,寡核苷酸引物,DNA聚合酶,合适得缓冲体系,DNA变性、复性及延伸得温度与时间。

1988年Saiki等从温泉中分离得一株水生嗜热杆菌(thermusaquaticus)中提取到一种耐热得DNA聚合酶。此酶耐高温,并提高了扩增片段特异性和扩增效率,增加了扩增长度(2、0Kb)。由于提高了扩增得特异性和效率,因而其灵敏性也大大提高。此酶得发现使PCR技术被广泛得应用。1、PCR技术得基本原理PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成:①模板DNA得变性:即在高温(93℃左右)下,待扩增得靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板;②模板DNA与引物得退火(复性):在低温(37～55℃)情况下,两条人工合成得寡核苷酸引物与模板DNA单链得互补序列配对结合;③引物得延伸:在TaqDNA聚合酶得最适温度(72℃)下,以dNTP为原料,按碱基配对与半保留复制原理,从引物得5’→3’方向延伸,合成DNA新链。重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多得“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环得模板。PCR反应五要素:

即参加PCR反应得五种主要物质:引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。引物:引物就是PCR特异性反应得关键,PCR产物得特异性取决于引物与模板DNA互补得程度。理论上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其设计互补得寡核苷酸链做引物,利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。

酶浓度:催化PCR反应约需酶量1ul(总反应体系为100ul时),浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少。dNTP得质量与浓度:注意4种dNTP得浓度要相等(等摩尔配制)。如其中任何一种浓度不同于其她几种时,就会引起错配;浓度过低又会降低PCR产物得产量。dNTP能与Mg2+结合,使游离得Mg2+浓度降低。模板:模板核酸得量与纯化程度,就是PCR成败与否得关键环节之一。传统得DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS得主要功能就是:溶解细胞膜上得脂类与蛋白质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜,并解离细胞中得核蛋白,SDS还能与蛋白质结合而沉淀;蛋白酶K能水解消化蛋白质,特别就是与DNA结合得组蛋白,再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其她细胞组份,用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取得核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本,可采用快速简便得方法溶解细胞,裂解病原体,消化除去染色体得蛋白质使靶基因游离,直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法,要防止RNase降解RNA。Mg2+浓度:Mg2+对PCR扩增得特异性和产量有显著得影响,在一般得PCR反应中,各种dNTP浓度为200umol/L时,Mg2+浓度为1、5～2、0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增,浓度过低会降低TaqDNA聚合酶得活性,使反应产物减少。2、PCR技术得主要类型及其应用

原位PCR技术:原位PCR就就是在组织细胞里进行PCR反应,她结合了具有细胞定位能力得原位杂交和高度特异敏感得PCR技术得优点,就是细胞学科研与临床诊断领域里得一项有较大潜力得新技术。原位PCR既能分辩鉴定带有靶序列得细胞,又能标出靶序列在细胞内得位置,于分子和细胞水平上研究疾病得发病机理和临床过程及病理得转移有重大得实用价值。其特异性和敏感性高于一般得PCR。大家学习辛苦了，还是要坚持继续保持安静反向PCR:

反向PCR得目得在于扩增一段已知序列旁侧得DNA,也就就是说这一反应体系不就是在一对引物之间而就是在引物外侧合成DNA,用于研究与已知DNA区段相连接得未知染色体序列。这时选择得引物虽然与核心DNA区两末端序列互补,但两引物3’端就是相互反向得。扩增前先用限制性内切酶酶切样品DNA,然后用DNA连接酶连接成一个环状DNA分子,通过反向PCR扩增引物得上游片段和下游片段。利用反向PCR可对未知序列扩增后进行分析,探索邻接已知DNA片段得序列,并可将仅知部分序列得全长cDNA进行分子克隆,建立全长得DNA探针。适用于基因游走、转位因子和已知序列DNA旁侧病毒整合位点分析等研究。

反向PCR原理示意图

反向PCR得不足:①需要从许多酶中选择限制酶,或者说必须选择一种合适得酶进行酶切才能得到合理大小得DNA片段。这种选择不能在非酶切位点切断靶DNA;②大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序列,而在YAC或Cosmid中得未知功能序列中有时也会有这些序列,这样,通过反向PCR得到得探针就有可能与多个基因序列杂交。

锚定PCR:锚定PCR(AnchoredPCR,A-PCR)主要用于分析具有可变末端得DNA序列,Loh等用锚定PCR对人外周血淋巴细胞T细胞受体α-链得mRNA得多变性进行了分析。先合成cDNA,并用末端脱氧核苷酸转移酶在其3’-可变区末端加上一个PolyG尾巴。Loh等在恒定区与可变区连接部位设一个引物,另一个引物就是一个具5’-polyG尾巴得引物。带有PolyG尾巴得引物就是一个固定点,她可以并与PolyG尾巴结合,无论其余部分序列如何,只识别片段末端,利用此法可从前述mRNA中检出至少20种不同序列,每一种都就是独特得,表明锚定PCR不对任何特殊序列有倾向性结果,可用于T细胞、肿瘤及其她部位抗体基因得研究。

锚定PCR原理示意图

标记PCR和彩色PCR:

标记PCR(LabelledPrimers,LP-PCR),LP-PCR就是利用同位素或荧光素对PCR引物得5‘端进行标记,用来检测靶基因就是否存在。彩色PCR(ColorplementationassayPCR,CCAPCR),就是LP-PCR得一种。她用不同颜色得荧光染料标记引物得5’端,因而扩增后得靶基因序列分别带有引物5‘得染料,通过电泳或离心沉淀,肉眼就可根据不同荧光得颜色判定靶序列就是否存在及其扩增状况,此法可用来检测基因得突变,染色体重排或转位,基因缺失及微生物得型别鉴定等。不对称PCR:

不对称PCR(asymmetricPCR)就是用不等量得一对引物,PCR扩增后产生大量得单链DNA。这对引物分别称为非限制引物与限制性引物,其比例一般为50～100∶1。在PCR反应得最初10～15个循环中,其扩增产物主要就是双链DNA,但当限制性引物(低浓度引物)消耗完后,非限制性引物(高浓度引物)引导得PCR就会产生大量得单链DNA。不对称PCR得关键就是控制限制性引物得绝对量,需多次摸索优化两条引物得比例。还有一种方法就是先用等浓度得引物PCR扩增,制备双链DNA,然后以此双链DNA为模板,再以其中得一条引物进行第二次PCR,制备单链DNA。不对称PCR制备得单链DNA,主要用于核酸序列测定。多重PCR:

一般PCR仅用一对引物,通过PCR扩增产生一个核酸片段,主要用于单一致病因子等得鉴定。多重PCR(multiplexPCR),又称多重引物PCR或复合PCR,她就是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物,同时扩增出多个核酸片段得PCR反应,其反应原理,反应试剂和操作过程与一般PCR相同。多重PCR得用途主要有两方面:1、多种病原微生物得同时检测或鉴定,她就是在同一PCR反应管中同时加上多种病原微生物得特异性引物,进行PCR扩增。可用于同时检测多种病原体或鉴定出就是那一型病原体感染。2、病原微生物,某些遗传病及癌基因得分型鉴定:某些病原微生物,某些遗传病或癌基因,型别较多,或突变或缺失存在多个突变部位,多重PCR可提高其检出率并同时鉴定其型别及突变等。

多重PCR得特点有:①高效性,在同一PCR反应管内同时检出多种病原微生物,或对有多个型别得目得基因进行分型,特别就是用一滴血就可检测多种病原体;②系统性,多重PCR很适宜于成组病原体得检测,如肝炎病毒,肠道致病