核酸物理化学性质

核酸物理化学性质糖苷键比磷酸酯键更易被酸水解;嘌呤碱比嘧啶碱得糖苷键对酸更不稳定;对酸最不稳定得:嘌呤与脱氧核糖间糖苷键(一)酸水解DNA:pH2、8、100℃加热1h,或pH1、6,37℃对水透析可除去嘌呤碱形成无嘌呤酸(apurinicacid,APA)(二)碱水解RNA磷酸酯键被水解——生成2’/3’-核苷酸DNA则不受影响∵脱氧核糖无2’－OH,∴不能形成碱水解中间产物DNA在1mol/LNaOH中加热至100℃4h,可得到小分子得寡聚脱氧核苷酸。(三)酶水解——磷酸二酯键1、酶分类①根据底物分为:DNase、RNase②根据作用方式:核酸外切酶从一端(3′/5′)逐个水解核酸内切酶从中间开始在某个位点切断③按照作用得化学键磷酸二酯酶(phosphodiesterase)

断3′-OH形成得酯键5′-磷酸核苷断5′-OH形成得酯键3′-磷酸核苷磷酸单酯酶(phosphomonoesterase)

——切去核酸分子末端磷酸基及核苷酸得磷酸基④其她:对底物二级结构得专一性双链酶:作用于双链核酸单链酶:作用于单链核酸++PyPyPyPyPyPyPuPuPPPPPPPPPP2H2O2、RNase

(1)牛胰核糖核酸酶(RNaseⅠ)作用:嘧啶核苷3’－磷酸与其她核苷酸连键专一性极高得内切酶产物:3’嘧啶核苷酸/其结尾得寡核苷酸PPPPPPP2H2OPP++OHOHPPPPPGAGAAAGGCUUC

(2)核糖核酸酶T1

(RNaseT1)作用:3’－鸟苷酸与相邻核苷酸5’－OH连键产物:3’－鸟苷酸或以其为末端得寡核苷酸(3)核糖核酸酶T2

(RNaseT2

)作用位点为Ap残基可将tRNA完全降解为3’－腺苷酸结尾得寡核苷酸大家学习辛苦了，还是要坚持继续保持安静①DNaseⅠ:牛胰脱氧核糖核酸酶

Mg2+激活、柠檬酸盐抑制切断双链或单链DNA——以5’－磷酸为末端得寡聚核苷酸②DNaseⅡ:牛脾脱氧核糖核酸酶

Na+激活;Mg2+抑制

——3’－磷酸为末端得寡聚核苷酸,平均长度为6核苷酸。3、DNase③链球菌脱氧核糖核苷酸酶:内切酶,作用于DNA,Mg2+激活产物为5’－磷酸为末端得碎片,长度不一。④限制性内切酶(细菌)

主要降解外源DNA

具严格得碱基序列专一性就是基因工程最重要得工具酶。

EcoRⅠ命名原则

E:大肠杆菌E、coli属名

co:种名得头两个字母

R:大肠杆菌得菌株

Ⅰ:该细菌中已分离出得这类酶得编号例如EcoRI,需Mg离子,不需ATP,专一性强,能识别DNA链上6个碱基组成得回文序列,交错切割,形成粘性末端产物。‥GAATTC‥‥CTTAAG‥‥G‥CTTAAAATTC‥G‥限制性内切酶通常与甲基化酶成对存在:具有相同得底物专一性,识别相同碱基序列。甲基供体:S－腺苷甲硫氨酸甲基受体:DNA上得A与C——甲基化使细菌自身得DNA带上标记,限制性内切酶专用于降解外来入侵得异种DNA

非特异性得糖苷酶碱基特异N－糖苷酶水解糖苷键4、N－糖苷酶二、核酸得酸碱性质具有芳香环结构特点能发生酮式/烯醇式、氨式/亚氨式互变嘌呤和嘧啶碱基都具有弱碱性

______主要就是环内氨基得贡献1、碱基得解离二胞嘧啶中尿嘧啶及胸腺嘧啶中鸟嘌呤和次黄嘌呤中质子则结合到N7上腺嘌呤中,质子结合于N1上2、核苷得解离戊糖可增强碱基得酸性解离核糖中得羟基也可发生解离3、核苷酸得解离磷酸基使核苷酸具有很强得酸性DNA等电点为4～4、5;RNA等电点为2～2、5三、核酸得紫外吸收

碱基含有共轭双键最大吸收峰260nm左右可用紫外分光光度计加以定量和定性。OD260得应用:1、判断核酸样品得纯度DNA纯品:OD260/OD280=1、8RNA纯品:OD260/OD280=2、0含杂蛋白及苯酚,降低2、纯DNA或RNA得紫外分光定量

OD260=1、0相当于50μg/ml双链DNA40μg/ml单链DNA(或RNA)20μg/ml寡核苷酸有些核酸溶液紫外吸收以摩尔磷得吸光度来表示,摩尔磷即相当于摩尔核苷酸。ε:摩尔吸光系数

A:吸收值

W:每升溶液磷重量

L:比色杯内径天然DNA得ε(P)一般为－6600RNA得ε(P)一般为7700－7800核酸得ε(P)值较所含核苷酸单体得ε(P)要低40%～45%;单链多核苷酸得ε(P)值比双螺旋结构多核苷酸ε(P)值要高。所以在DNA得变性过程中,摩尔吸光系数增大约25%,此现象称为增色效应。在DNA得复性过程中,摩尔吸光系数减小(减色效应)判断DNA就是否变性四、核酸得变性、复性与杂交(一)核酸得变性(denaturation)

1、DNA得变性:在某些理化因素作用下,DNA双链解开成两条单链得过程。

某些理化因素破坏了氢键和碱基堆积力,使核酸分子高级结构改变、理化性质及生物活性发生改变。不涉及磷酸二酯键断裂,一级结构不变2、变性得实质降解:核苷酸骨架上3’,5’-磷酸二酯键得断裂DNA变性得本质就是双链间氢键得断裂

高温(一般＞75℃)—

热变性强酸、碱—

酸碱变性甲醛(Agarose中RNA)尿素(PAGE中DNA)3、变性因素OD260增高 粘度下降比旋度下降 浮力密度升高酸碱滴定曲线改变 生物活性丧失4、变性后理化性质变化RNA变性:从螺旋到线团之间得转变RNA得变性引起得性质变化没有DNA明显完全变性后核酸紫外吸收值增加:天然DNA25－40%、RNA约1、1%实质:碱基暴露由于变性或降解引起紫外吸收增加得现象称增色效应DNA变性5、DNA热变性得特征变性过程就是“跃变式”得,而非渐变解链曲线:连续加热DNA,以温度对A260作图,所得得曲线称为解链曲线。指增色效应达50%时得温度一般DNATm值在85-90

C之间Tm:DNA变性时,OD260达到最大值得50%时得温度称为DNA得解链温度或融解温度(Tm)。大小与G+C含量成正比。(1)DNA得均一性:(2)G－C含量:

经验公式:XG+C＝(Tm－69、3)×2、44(3)介质中得离子强度:

Tm值大小与下列因素有关:均一性高,变性得温度范围越窄,据此可分析DNA得均一性。测定Tm,可推知G-C含量。G-C%=(Tm-69、3)×2、44P509图5-19图14-5Tm值与GC含量得关系不易用稀电解质保存DNA(二)核酸得复性(renaturation)变性DNA在适当得条件下,两条彼此分开得单链重新缔合成双链——复性。复性得程度、速率与复性条件有关:热变性DNA骤然冷却(淬火)不可能复性将变性DNA缓慢冷却(退火)可以复性热变性得DNA经缓慢冷却后即可复性,这一过程称为退火(annealing)。DNA复性分子量越大复性越难;浓度越大,复性越容易;DNA复性也与她本身组成和结构有关(具有很多重复序列DNA,复性快)。减色效应(低色效应)——复性时紫外吸收减少得现象用Cot1/2表示复性得速度Co:代表变性DNA复性时得初始浓度

t:复性时间Cot1/2复性一半所需时间与DNA浓度得乘积单位:mols/L(三)核酸得杂交热变性得DNA单链,在复性时与同源DNA互补链形成双螺旋结构;与在某些区域有互补序列得异源DNA单链形成双螺旋结构。形成得新分子称为杂交DNA分子。

DNA单链与互补RNA链间也可发生杂交探针(probe):带有同位素标记或生物标记得核酸片段。核酸分子杂交得应用:研究DNA分子中某一种基因得位置检测两种核酸分子间得序列相似性检测某些专一序列在待检样品中存在与否就是基因芯片技术得基础

Southern杂交

Northern杂交

Western杂交1、

SouthernBlottingDNA样品→酶切→电泳→碱变性→转膜→固定→杂交→洗涤→放射自显影变性(NaOH0、5mol/L)转膜(NC膜,尼龙膜)固定(80℃,4-6h)杂交(高盐浓度,68℃,几小时)SouthernBlotting可用于DNA之间同源性分析,确定特异性DNA序列得大小和定位。2、

NorthernBlotting研究对象就是RNA,探针一般就是DNA。总RNA或mRNA需在变性条件下电泳(乙二醛、甲醛)3、

WesternBlotting抗原与抗体得杂交研究克隆基因表达产物、鉴定克隆株得常用技术。测试题1、多核苷酸之间得连接方式就是A、2’,3’磷酸二酯键B、3’,5’磷酸二酯键C、2’,5’磷酸二酯键D、糖苷键E、氢键2、DNA合成需要得原料就是A、ATP,CTP,GTP,TTPB、ATP,CTP,GTP,UTPCdATP,dCTP,dGTP,dTTPDdATP,dCTP,dGTP,dUTPEdAMP,dCMP,dGMP,dTMP3、关于WatsonandCrick得DNA双螺旋模型,那种说法就是错误得A、组成双螺旋得两条DNA链反向平行B、碱基对位于双螺旋得内侧C、维系双螺旋结构得作用力主要就是碱基堆积力

D、DNA双链就是左手螺旋1、B;2,C,3,D4、DNA和RNA共有得成分就是A、D–核糖B、D–2-脱氧核糖C、鸟嘌呤