DB2305-T 033-2024 玉米茎基腐病抗性筛选及鉴定技术规程

ICS65.020.20DB23052024-08-30发布双鸭山市市场监督管理局发布IDB2305/T033—2024本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由双鸭山市农业农村局提出并归口。本文件起草单位：宝清县小城子镇乡村振兴发展服务中心、黑龙江省农业科学院佳木斯分院、芜湖职业技术学院、宝清县朝阳镇乡村振兴发展服务中心。本文件主要起草人：邱磊、杨晓贺、顾鑫、于昌红、丁俊杰、毕永彬、蒋佰福、牛忠林、吴丽丽、靳晓春、李如来、刘伟、王庆胜、李志民、李增杰、朱宝国、姚亮亮、张茂明、王自杰、张家智、高雪1DB2305/T033—2024玉米茎基腐病抗性筛选及鉴定技术规程本文件规定了玉米茎基腐病抗性筛选及鉴定技术的术语和定义、接种圃设计、接种方法、抗性评价、田间档案的技术要求。本文件适用于玉米茎基腐病的田间筛选及鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB4404.1粮食作物种子第1部分:禾谷类NY/T1248.7玉米抗病虫性鉴定技术规范第7部分:镰孢茎腐病DB23/T017玉米生产技术规程3术语和定义NY/T1248.7界定的及下列术语和定义适用于本文件。3.1玉米茎基腐病玉米茎腐病又称青枯病、萎蔫病、茎基腐病，是成株期茎基部腐烂病的总称，属世界性病害。由禾谷镰孢菌、轮枝镰孢菌和腐霉菌等多种病原菌单独或复合侵染引起的土传病害。玉米散粉至成熟期的气候条件，特别是雨量与发病关系十分密切，高温、高湿利于发病，雨后暴晴，常出现发病高峰。3.2病原菌形态特征玉米茎基腐病是由多种病原菌引起的土传病害，其中包括真菌和细菌。真菌型茎基腐病的主要病原菌有腐蠹菌、镰刀菌和炭疽菌等。腐霉菌的形态特征包括菌丝发达、无隔、白色棉絮状，孢子囊丝状体不规则膨大，藏卵器平滑，卵孢子球形、光滑。镰刀菌则产生分生孢子，其有性型为子囊菌，分生孢子镰刀形，无色透明，有3或5个分隔。炭疽菌的形态特征包括分生孢子盘、分生孢子单胞、暗色或无色等。细菌型茎基腐病的病原菌包括菊欧文氏菌玉米致病变种和玉蜀黍假单胞菌假单胞菌，它们的菌体杆状，两端钝圆，革兰氏染色阴性，周生鞭毛，无芽孢和荚膜。2DB2305/T033—20244接种圃设计4.1病圃选择应选择光照充足、地势平坦、耕层深厚，肥力较高，保水保肥性能好，排灌良好的地块。以保证玉米种质资源后期正常生长并完成田间筛选与鉴定。4.2田间设计将获得的玉米现有推广品种及玉米自交系随机排列种植，每隔50份材料设置1组已知抗病、感病对照材料，对照选用玉米自交系齐319(高抗)、掖478(高感)。鉴定设计符合NY/T1248.7标准。玉米材料采用双行区种植，小区行长4m，行距0.68m，植株密度为5000株/667m2。4.3田间播种应在耕层5cm～10cm地温稳定通过7℃~8℃,土壤含水量25%～30%适时播种，也可根据当年农业生产气候条件适当调整播种期。播种时期符合DB23/T017标准。所种植种子不进行任何处理，播种方式采用人工播种，穴距19.6cm，每穴播2粒，出苗后每穴保留1株健康的植株。种子符合GB4404.1标准。4.4间苗定苗玉米3叶间苗，5叶定苗。4.4中耕管理田间管理及虫草害防治与大田生产相同，田间管理过程中不使用对茎基腐病有防治作用的药剂，生产过程符合DB23/T017-2008标准。5接种方法5.1病菌采集5.1.1采样地点选择在双鸭山市玉米茎基腐病高发区域进行采样，获取具有代表性的病害样本。5.1.2样本采集在发病部位采集玉米茎秆及维管束组织。3DB2305/T033—20245.1.3样本处理使用流动的清水轻轻冲洗样本，以去除泥土和表面的杂质。使用无菌的剪刀或手术刀，将玉米茎部从健康区域和病害区域仔细切割开来,病害区域的样本应该包括可见的病斑及其周围的健康组织，以便于后续的显微观察和病原检测。将切割好的样本分别放入无菌的塑料袋或培养皿中。每个样本应该有明确的标签，记录样本的来源、采集日期和其他相关信息。使用冰袋或冷藏箱保持样本在适宜的低温条件下，以防止样本变质。在实验室中，样本应按照标准的微生物检测程序进行处理和分析。5.2病菌制备5.2.1微生物分离通过稀释培养法和平板对峙法从采集的样本中分离出具有拮抗活性的微生物菌株。具体方法是取病健交接部分的组织，置于75%的酒精中浸泡2s～3s，取出后置于质量体积比为1%的次氯酸钠中浸泡2min～3min，再经无菌水换洗，晒干后转移至PDA平板培养基中，置于25℃~27℃环境中，黑暗培养3d后挑取病原菌至试管中保存。5.2.2菌株鉴定依据柯赫氏法则进行致病力测定，确定其为玉米茎基腐病病原菌的菌株,对分离出的菌株进行形态学、生理生化特征和分子生物学鉴定进行属种鉴定,从比例占绝对优势的病原菌中选取致病力较强的菌株作为接种的目标菌株。5.2.3菌株培养选择具有良好拮抗效果的菌株进行培养，以获得足够数量的菌株用于后续实验。具体方法是目标菌株，接种到PDA平板培养基上并生长7d后,取直径7mm的菌碟接种到高粱粒培养基（高梁粒用开水煮20min后,转移至三角瓶中121℃灭菌45min）中，每个三角瓶中接种5个～7个菌碟，26℃黑暗培养，每天振荡三角瓶1次～2次，震荡时间3min～5min，待菌丝长满每个高粱粒的表面，常温阴干，以留备用。5.3接种时期接种时期为抽雄初期至吐丝初期，可全天进行田间人工接种。5.4接种步骤采用土壤接种法，接种时将玉米现有推广品种及玉米自交系根系一侧土壤挖开（深约5cm～10cm露出部分根系，将长满病原菌的高粱粒接种在露出的根系处，每株接种30粒，接种后及时覆土，并保持土壤湿润。4DB2305/T033—20245.5接种管理在病圃中铺设喷带的灌溉设施，每天喷水10min～20min，试验地保持土壤中含充足水分。接种圃土壤湿度不低于30%。5.6结果调查玉米乳熟后期进行田间调查。逐株检査植株基部茎节，凡茎节变软、变褐色者，记为茎基腐病株。分别计算各鉴定材料的病株率，按病株率评价抗性，抗性评价标准见表1。发病率（%）=发病株数/总株数表1玉米茎基腐抗性评价标准6抗性评价6.1鉴定有效性判定若感病对照品种发病率超过40%时，该批次鉴定有效。6.2非一致性抗性判定6.2.1同一种质在2年的鉴定结果中，2年的抗性级别是一致的，则此抗性级别作为最终鉴定结论。6.2.2同一种质在2年的鉴定结果中，相差一个抗性级别，则以最低抗性级别为准。6.2.3同一种质在2年的鉴定结果中，抗性级别相差2个及以上级别，则进行第三次鉴定。若高感对照品种发病率超过40%时，该批次鉴定有效。6.3玉米筛选对玉米现有推广品种进行接种鉴定时，优先选择高抗及中抗品种；结合产量性状可以使用中感品种，并注意田间大斑病的综合防治；慎重使用或者不建议推广感病及高感玉米品种。如果所鉴定的玉米自交系发病株不超过10%，即病级为高抗及抗病，则视为该自交系适用于抗玉米茎基腐病的育种材料，结合田间其他农艺性状进行重点利用。如果所鉴定的玉米自交系发病株在5DB2305