DB34T∕ 2795-2016 猪传染性胃肠炎病毒与猪流行性腹泻病毒二重RT∕-PCR检测方法　　

猪传染性胃肠炎病毒与猪流行性腹泻病毒DuplexRT-PCRassayfordetectionofpHYPERLINK安徽省质量技术监督局发布I本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由安徽省农业科学院畜牧兽医研究所提出。本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：安徽省农业科学院畜牧兽医研究所。本标准起草人：潘孝成、张丹俊、赵瑞宏、沈学怀、戴银、胡晓苗、杨永新、周学利、侯宏艳、王重龙、李庆岗、张玉、王杨龙、陈福军、何为俊。1猪传染性胃肠炎病毒与猪流行性腹泻病毒二重RT-PCR检测方法PBS:磷酸缓冲液(phosphatebuffersolution)TAE:Tris-乙酸电泳缓冲液(trisHYPERLINK3.2台式低温高速离必机(最大离心使2000g传播或其他用途3.5冰箱(-20℃;-80℃)。3.7分析天平(准确度0.01g以上)。24.1RNA抽提试剂：Trizol或其他商品化RNA提取试剂。4.2氯仿、异丙醇、无水乙醇。4.3M-MLV反转录酶。4.4RNA酶抑制剂。4.5DEPC处理的灭菌水。4.6TaqDNA聚合酶。4.8DNA分子质量标准(DL2000DNAMarker)。4.9RT-PCR反应试剂。4.10EB(10μg/μL)或核酸染料。4.11磷酸盐缓冲液(PBS,0.01mol/L,pH7.2),见附录A中的A.1。4.1250×TAE电泳缓冲液，见附录A中的A.2。4.131%琼脂糖凝胶，见附录A中的A.3。CCCATGAAGCACTTTCTCACTATC-3’,引物浓度均为10pmol/μL。4.15对照样品：——阳性对照样品：猪传染性胃肠炎病毒(VERO细胞培养)与猪流行性腹泻病毒(PK15细胞培养)的细胞培养混合物或猪传染性胃肠炎-猪流行性腹泻-猪轮状病毒三联弱毒冻干活疫苗；——阴性对照样品：正常细胞培养混合物(VERO和PK15细胞)、正常猪肠道内容物或正常猪粪便样品。5样品的采集及处理5.1采样工具15mL离心管、1.5mL离心管、剪刀、镊子和研钵，经121(±2)℃,15min高压灭菌并烘干。5.2采样方法采取病死或剖杀猪的小肠丙容物×1流左岩，按1:5倍体积加入PBS,研磨冻融-3次，装入15mL灭菌离心管中，8000g离心10min,取上清液转入1.5mL离心管中，-80℃保存备用。5.2.2粪便的采集与前处理取发病猪新鲜粪便，装入15mL灭菌离心管中，按1:5倍体积加入PBS,涡旋仪上振荡混匀20min,8000g离心10min,取上清液转入1.5mL离心管中，-80℃保存备用。5.2.3细胞培养物细胞培养物冻融3次，转入1.5mL离心管中，-80℃保存备用。36.1.412000g4℃离心15min,吸取上清液移入新的离心管中(注意不要吸出中间层),加入等体6.1.512000g4℃离心10min,小心弃去上清液，加入75%乙醇1mL(DEPC水配制)。——5×RTBuffer4μL,RNaseInhibitor(40U/μL)0.5μL,M-MLV反转录酶(200U/μL)1μL,6.2.4PCR仪中，42℃作用60min,再70℃作用15min,-20℃保存备用。94℃预变性5min后；94℃1min,55℃50s,72℃1min,35个循环；最后72℃延伸10min。HYPERLINK4M,DL2000Marker;1,阳性对照样品；4,阴性对照样品。HYPERLINK5(规范性附录)A.1.10.2mol/L磷酸氢二钠溶液：称取磷酸氢二钠(Na₂HPO₄12H₂O)71.6g,先加适量灭菌去离子水溶解，最后定容至1000mL,混匀。A.1.20.2mol/L磷酸二氢钠溶液：称取磷酸二氢钠(NaHPO₄H₂O)27.6g,先加适量灭菌去离子水溶解，最后定容至1000mL,混匀。A.1.3量取0.2moL/L磷酸氢二钠溶液36mL,0.2mol/L磷酸二氢钠溶液14mL,称取氯化钠8.5g,加灭菌去离子水800mL,调pH值至7.2,最后定容至1000mL,4℃保存。A.2电泳缓冲液(50倍)二水乙二铵四乙酸二钠(分析纯)灭菌双蒸水氢氧化钠(分析纯)灭菌双蒸水A.2.2TAE电泳缓冲液(50×)羟基