DB34T∕ 2791-2016 鸭坦布苏病毒分离鉴定技术规程

TechnicalRegulationforIsolationandIdentificationofduckTembusuVirusHYPERLINK安徽省质量技术监督局发布I本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。1鸭坦布苏病毒分离鉴定技术规程本标准规定了鸭坦布苏病毒病料采集与处理、病毒接种及鉴定技术。本标准适用于鸭坦布苏病毒的分离与鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。DB34/T1938鸭黄病毒感染诊断技术规程3试验材料、试剂3.19～11日龄SPF鸡胚3.211日龄鸭胚3.3乳仓鼠肾细胞(BHK-21)3.4DMEM培养基3.5胎牛血清3.60.01mol/LpH7.0～7.4磷酸盐缓冲液(PBS)3.7TAE缓冲液(50×)3.8青霉素、链霉素3.9琼脂糖3.10鸭坦布苏病毒琼脂扩散抗原(由鸭坦布苏病毒安徽分离株醛灭活制备而成)3.11鸭坦布苏病毒琼脂扩散抗体(由鸭坦布苏病毒安徽分离株油乳佐剂灭活制剂免疫健康兔，份离血清制备而成)4病料采集与处理4.1病料的采集无菌采集疑似鸭坦布苏病毒感染的病鸭卵巢、输卵管、胰腺和脑组织。样品应置于-80℃冻结保存。4.2病料的初步处理先将病料组织剪碎、研磨，用灭菌PBS与样品按体积质量比5:1匀浆，将样品匀浆放置于-20℃中冷冻，再室温融解，反复三次。经5000r/min离心10min,取上清，并加入青霉素和链霉素，终浓度为2000IU/mL,0.22μm过滤除菌，置于-80℃待用。25病料接种将上述病毒分离材料，以0.2mL/胚的接种量通过尿囊腔接种5枚9～11日龄SPF鸡胚，置37℃孵化箱内孵育，每天照胚2～4次，弃去24h内死亡的鸡胚，孵化至120h,将鸡胚放置4℃冰无菌操作收集24h以后死亡鸡胚及120h仍存活鸡胚的尿囊液，并观察病变。将上述病毒分离材料，以0.2mL/胚的接种量通过尿囊腔接种5枚11日龄鸭胚，其余方法同取密度80%左右的单层BHK-21细胞，弃去培养液，用灭菌PBS清洗三次，接种0.5mL处理好的病料，置于5%CO₂培养箱，37℃下吸附1～2h,期间每隔15min轻轻摇晃一次。吸附完后，弃去病料液，用灭菌PBS清洗三次，加入适量细胞维持液继续培养，37℃CO₂培养箱内继续培养4d。在培养过程中每日观察细胞病变(CPE)产生情况，如出现CPE(特征病变为：细胞间隙增大、细胞核固缩、细胞圆化脱落),收集细胞培养上清及细胞裂解液。同时设立不接种样品的空白细胞对照瓶。6病毒鉴定1938鸭黄病毒感染诊断技术规程，或者使用琼脂扩散试验对鸭坦布苏病毒进行鉴定。用1×TAE缓冲液配置1%琼脂糖，煮沸溶解，冷却至60℃左右，倒入平皿(直径9cm)中制作琼脂糖凝胶板，琼脂糖凝胶厚度约4mm,完全凝固后备用。用梅花打孔器在上述琼脂糖凝固板上打孔，用孔径5m、孔距奮品射孔结束店取适量1%琼脂7.3加样用移液器在中间孔加入坦布苏病毒阳性血清，1号孔加入坦布苏病毒琼扩标准抗原，2～6号孔加每孔样品加满，不可溢出(图1)。完成加样后，将琼脂板倒置放入湿盒内，置于37℃培养箱中24～36h。35423图18结果判定8.1由本病毒致死的鸡胚及鸭胚具有基本相同的肉眼病变。胚体小、绒毛尿囊膜增厚、胚体充血及胚肝出血。8.2BHK-21细胞接种病料48h后，开始出现细胞核固缩、细胞圆化脱落。8.3RT-PCR检测结果出现目的片段时，初步判定为鸭坦布苏病毒阳性。8.4被检样品孔与阳性血清孔之间形成一条致密白色沉淀带，并与阳性对照沉淀带平滑相连，即可判断为阳性。8.5被检样品孔与阳性血清孔之间无沉淀带出现；出现的沉淀带与阳性对照交叉或者不相连，为非特异性反应，也判定为阴性。8