酱菜中亚硝酸盐含量的测定分析研究 化学工程与工艺专业

酱菜中亚硝酸盐含量的测定摘要蔬菜容易富集硝酸盐，用蔬菜腌制酱菜时，会将蔬菜中的硝酸盐转化为亚硝酸盐，并随酱菜一起进入人体内，对人体造成伤害。本文主要采用盐酸萘乙二胺分光光度法和高效液相色谱法测定酱菜中亚硝酸盐的含量。详细描述两种方法的实验过程，并通过实验得出实验数据和实验结果。并将两种方法作比较，高效液相色谱法测定酱菜中亚硝酸盐时快速简便，应用范围广，但是仪器设备昂贵。同时本法测定酱菜中亚硝酸盐的含量，根据其回收率试验结果，液相色谱图和它的标准曲线，线性范围大，拥有较高的灵敏度和准确度等优点。样品中的其他组分如脂肪，蛋白质等对其检验不会造成干扰，与国家标准法相比较，测定的结果也没有显著的差异。盐酸萘乙二胺分光光度法具有应用广泛、灵敏度高、选择性好、准确度高、分析成本低、操作简便、快速的特点，但只能测定亚硝酸盐，不能同时测其它物质。酱菜中的亚硝酸盐含量在不超过20mg／kg时，符合我国卫生标准规定。经实验结果表明，酱菜中的亚硝酸盐含量符合国家标准。关键词：酱菜,亚硝酸盐,高效液相色谱法,盐酸萘乙二胺分光光度法DeterminationofnitriteinpicklesABSTRACTVegetablesareeasytoaccumulatenitrate,pickledvegetableswithvegetables,vegetableswillbenitrateintonitrite,andalongwithpicklesintothehumanbody,causingharmtothehumanbody.Inthispaper,thecontentofnitriteinpickleswasdeterminedbyspectrophotometryandhplc.Theexperimentalprocessofthetwomethodsisdescribedindetail,andtheexperimentaldataandexperimentalresultsareobtained.Comparedwiththetwomethods,theHPLCmethodissimpleandconvenientforthedeterminationofnitriteinpickles.Atthesametime,thecontentofnitriteinpickledvegetableswasdeterminedbythismethod.Accordingtotheresultsoftherecoverytest,theliquidchromatographyanditsstandardcurvehadalargelinearrangeandhighsensitivityandaccuracy.Theothercomponentsinthesample,suchasfat,proteinandsoon,donotinterferewiththetest.Comparedwiththenationalstandardmethod,theresultsarenotsignificantlydifferent.Withwideapplication,highsensitivity,goodselectivity,highaccuracy,analysisofthecharacteristicsoflowcost,simpleoperation,fast-naphthylethylenediaminedihydrochloridespectrophotometricmethod,butonlyforthedeterminationofnitrite,othersubstancescannotbemeasuredatthesametime.China'shealthstandards,nitriteresiduesinpicklesshouldnotexceed20mg/kg.Theexperimentalresultsshowthatthecontentofnitriteinpicklesisqualified.KEYWORDS:PicklesNitriteHighperformanceliquidchromatographyHydrochloricacidnaphthylethylenediaminespectrophotometricmethod目录第一章前言....................................................................................................................11.1研究背景.........................................................................................................11.2国内外研究现状.............................................................................................11.2.1光谱法.................................................................................................11.2.2色谱法.................................................................................................11.2.3研究内容.............................................................................................2第二章实验部分............................................................................................................32.1盐酸萘乙二胺分光光度法法.........................................................................32.1.1实验原理.............................................................................................32.1.2仪器与试剂.........................................................................................42.1.3实验步骤.............................................................................................42.1.4紫外-可见分光光度计的使用方法...................................................42.1.5数据处理.............................................................................................42.2高效液相色谱法.............................................................................................82.2.1实验原理.............................................................................................82.2.2仪器与试剂.........................................................................................82.2.3实验条件............................................................................................82.2.4实验步骤.............................................................................................92.2.5液相色谱仪的使用.............................................................................92.2.6数据处理...........................................................................................102.3结果与讨论...................................................................................................122.3.1实验结果..........................................................................................122.3.2实验方法比较..................................................................................12第三章总结与展望......................................................................................................13参考文献......................................................................................................................15致谢..............................................................................................................................16第一章前言1.1研究背景随着社会的发展，生活水平的提高，食品的安全问题越来越受到人们的广泛关注。硝酸盐和亚硝酸盐广泛存在于土壤、水域及植物中，在绿色蔬菜中亚硝酸盐含量较高，大多数蔬菜都可测出一定量的亚硝酸盐。可见亚硝酸盐并不神秘，它广泛存在于我们的生活中。其中，人体摄入的硝酸盐和亚硝酸盐70%-80%来自蔬菜。亚硝酸盐通常会作为发色剂、抗氧化剂、防腐剂等食品添加剂加入到食品中。因为亚硝酸盐即可使食品具有较鲜亮的颜色和独特的味道，又可抑制毒梭菌的生长和其他毒素的产生。亚硝酸盐跟随食物一起被摄入人体内，过多的摄入亚硝酸盐会导致血红蛋白发生病变从而失去携氧功能，导致组织细胞缺氧，患高铁血红蛋白症的几率增加，严重者可致死，此外当摄入的其他仲胺等物质时，可与亚硝酸盐相互结合转化成强致癌物，从而诱发消化系统癌变[1]。因此，寻找即能够降低亚硝酸盐在食品中的使用量；又能够增加食品营养的食品添加剂。这将成为食品研究的重要领域和制作的发展趋势。1.2国内外研究现状由亚硝酸盐引起的各类食品中毒事件，在我国食品中毒事件中位居前列。亚硝酸盐在各国常被作为食品添加剂加入至各类食品中，并具有增色，抑菌和增加口感等作用。当人体摄入0.3-0.5g亚硝酸盐会导致中毒，摄入3g亚硝酸盐会导致死亡，从而可以看出亚硝酸盐具有较强的毒性。由于亚硝酸盐被大量作为添加剂使用，不良的操作行为等原因导致食品中亚硝酸盐残留过高，从而导致亚硝酸盐食品中毒事件时有发生[2]。国内外检测亚硝酸盐含量的方法多种多样，主要包含光谱法和色谱法两大类，还包含快速检测法等多种方法。在光谱发中常用来检测亚硝酸盐含量的方法为分光光度法，该方法操作简便，连续性强，精密度高，适用范围广。在色谱法中常用的检测方法为高效液相色谱法，该方法具有快速、准确、灵敏度和精密度高的优点，能满足同步测定食品中亚硝酸盐含量的要求[3]。缺点是所用试剂有毒，对实验人员与环境有危害。1.2.1光谱法分光光度法是光谱发中常见的测定亚硝酸盐的方法，分光光度法是利用测量有色物质在某一单色光出的吸收程度来定量的特点而建立起来的一种分析方法。紫外-可见分光光度法是分光光度法中最常用的检测方法，其中最为经典的是盐酸萘乙二胺分光光度法，这一方法的原理是在一定的酸度条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮反应，在与盐酸萘乙二胺偶合形成紫红色染料，使用紫外-可见分光光度计进行检测，在540nm附近有最大波长。因其投资相对较小、操作简单从而被广泛应用。1.2.2色谱法高效液相色谱法是色谱法中检测亚硝酸盐最常用的方法。这一方法的实验原理是除去样品中蛋白质、脂肪后，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮反应，再与N-1-萘乙二胺偶合之后，进行色谱分析。若采用反相高效液相色谱法测定酱菜制品中亚硝酸盐的含量，则该方法应选择四丁基溴化铵作为离子对试剂，与亚硝酸盐的阴离子形成中性缔合物，采用甲醇-混合磷酸盐作为流动相，使用非极性键合相柱进行分离并定量检测。反相高效液相色谱法具有快速、准确、灵敏、线性范围大等优点，并能够同时测定酱菜制品中亚硝酸盐和其他组分的含量，样品中的其他组分如脂肪、色素、蛋白质等对其检测不构成干扰。测定结果与国家标准法比较，并无显著性差异。1.2.3研究内容酱菜的主要原料是新鲜蔬菜，利用各种不同的腌渍工艺制作而成的蔬菜制品。作为常用的食品添加剂中的发色剂和防腐剂的硝酸盐和亚硝酸盐，其大量存在于各类腌酱食品中，并且在酱腌菜的生产过程中和长期储存中，部分硝酸盐会转化为亚硝酸盐。很久之前我国就已经开始食用酱菜类食品，其中酱萝卜是人们喜爱的佐餐食品之一。所以本文选择已腌制完成并储藏一段时间的酱萝卜为试验样品，经过样品前处理后，使用盐酸萘乙二胺反光光度法和反相高效液相色谱法对其含有的亚硝酸盐含量进行测定并进行数据处理，从而了解酱菜中含有的亚硝酸盐含量是否符合国家标准。第二章实验部分2.1盐酸萘乙二胺分光光度法2.1.1实验原理样品除去蛋白质和脂肪后，在一定的酸度条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮反应，在与盐酸萘乙二胺偶合形成紫红色染料。使用紫外-可见分光光度计进行检测，在540nm附近有最大波长。2.1.2仪器与试剂氯化铵缓冲溶液(pH9.6~9.7)：量取250.0mL蒸馏水至500mL容量瓶中，准确量取10.00mL盐酸并移入容量瓶中，震荡摇匀，准确量取25.00mL氢氧化铵并移入容量瓶中，加水稀释至刻度线，摇匀，待用。氢氧化钠溶液（0.50mol/L）：准确称取5.00g氢氧化钠，加水溶解，并转移至250mL容量瓶中，加水稀释至刻度线，摇匀，待用。硫酸锌溶液（0.45mol/L）：准确称取30.00g硫酸锌（ZnSO4·7H2O），加水溶解并转移至250mL容量瓶中，加水稀释至刻度线，摇匀，待用。对氨基苯磺酸溶液：准确称取2.50g对氨基苯磺酸，溶解于175mL水和75mL冰乙酸中，放置于500mL棕色瓶中，摇匀，室温保存，待用。盐酸萘乙二胺溶液（1g/L）：准确称取0.2g盐酸萘乙二胺至烧杯中，加入60%乙酸溶液溶解，并转移至200mL棕色容量瓶中，加水稀释，摇匀，在冰箱中保存，稳定一周，待用。显色剂：使用已配置好的盐酸乙二胺溶液和对氨基苯磺酸溶液等体积混合，待用。亚硝酸钠标准溶液：准确称,125.0mg的亚硝酸盐于硅胶干燥器中并干燥24小时，干燥完成后，加水溶解，并转移至250mL容量瓶中，加入50.0mL氯化铵缓冲溶液，加水稀释至刻度线，摇匀，放置于4℃处并避光保存，待用。亚硝酸钠标准使用溶液：临用前，吸取2.00mL的亚硝酸钠标准溶液，放置于200mL容量瓶中，加水稀释至刻度线，待用。紫外-可见分光光度计：UV-722N型紫外-可见分光光度计分析天平：万分之一电子天平比色管：50mL，8个移液管：25.00mL，1.00mL，各一根容量瓶：200mL，2个，250mL，5个，500mL，2个小型粉碎机若干烧杯若干量筒水浴锅漏斗2.1.3实验步骤（1）样品处理将酱菜置于打碎机中打碎，混匀后，从中称取约10.0g酱菜并置于100mL的烧杯中，加70mL水和12mL氢氧化钠溶液，摇匀。加入适量的氢氧化钠溶液，将样品的pH值调为8，并转移至250mL容量瓶中加10mL硫酸锌溶液，摇匀。如不产生白色沉淀，再补加2-5mL氢氧化钠，摇匀。置于60℃水浴中，加热10分钟，取出后冷却至室温，加水至刻度线，摇匀。放置0.5小时，用滤纸过滤，弃去初滤液20mL，收集待测。(2)测定亚硝酸盐标准曲线的制备：吸取0,0.5,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0mL亚硝酸盐标准使用液，相当于0,2.5,5,10,15,20,25μg亚硝酸钠。分别置于50mL带塞比色管中。在比色管中加入9.0mL氯化铵缓冲液，在加入5.0mL60%乙酸后，立即加入5.0mL显色剂，加水至刻度线，摇匀，在暗处静置25分钟。用1cm比色皿，以零管调节零点，于波长540nm处测吸光度，绘制标准曲线，。样品测定：吸取10.0mL上述滤液于50mL带塞比色管中，加入9.0mL氯化铵铵缓冲液，在加入5.0mL60%乙酸后，立即加入5.0mL显色剂，加水至刻度线，摇匀，在暗处静置25分钟。用1cm比色皿，以零管调节零点，于波长540nm处测吸光度，查标准曲线得相应的亚硝酸盐含量，并计算出实际样品中的亚硝酸盐的含量。空白试样用蒸馏水代替样品以相同步骤测量。2.1.4紫外-可见分光光度计的使用方法开机检测首先检查仪器是否有毁坏后，连接电源，打开电源开关。打开吸收池样品室盖，取出样品室内遮光物，预热20min以上。对可见光区波长的准确度进行检测和校正。吸收池的配套检测石英吸收池在220nm处，玻璃吸收池在440nm处，装入适量的蒸馏水，以一个吸收池为参照物，测量其透射比，透射比的偏差小于0.5%则证明可以配套使用。样品测量首先使用标准溶液找出最大吸收波长，再在最大吸收波长下测出样品的吸光度。结束工作取出吸收池，倒出液体，清洗并晾干后放入盒中保存。将干燥剂放入样品室内，盖上样品室盖，关闭电源，清理工作台。2.1.5数据处理2.1.5.1实验条件优选（1）pH值配置一系列被测物质溶液酸度不同，浓度相同，显色剂用量相同的溶液，并依次测量其吸光度，做出A-pH曲线，找出最合适的溶液pH值。表2.1不同酸度值的吸光度酸度值45678910吸光度（A）0.2940.4680.5970.6930.7180.6920.624图2.1A-pH曲线由实验知，当pH=8时，最有利于实验的进行。（2）显色剂用量相同显色剂用量首先配置一系列被测物质浓度相同显色剂用量不同的溶液，依次测量其吸光度，做A-cr曲线，找出曲线平台部分，选择一个合适的用量。表2.2不同用量显色剂的吸光度显色剂用量(mL)0.01.02.03.04.05.06.007.08.0吸光度（A）0.000.2760.4620.5880.6760.7160.6920.6320.544图2.2A-cr图像由实验知，当加入5.00mL显色剂时，最有利于实验的测定。（3）吸收曲线在实验中入射光波长应选择被测物质的最大吸收波长的光为入射波长，这样灵敏度高，准确度也好。当有干扰物质存在时，应遵循“吸收最大，干扰最小”的原则，来选择波长。所以在做实验时应先找出被测物质的最大吸收波长。表2.3不同波长的吸光度波长520522524526528530532吸光度0.2460.2960.3450.3910.4350.4990.564波长534536538540542544546吸光度0.6110.6490.6910.7240.7120.6900.654波长548550552554556558560吸光度0.6010.5450.4610.4110.3240.2450.214表2.4不同波长的吸光度波长536537538539540光度0.6490.6670.6910.7050.724波长541542543544545吸光度0.7200.7120.6950.6900.668由实验知，当波长为540nm时有最大吸收波长。2.1.5.2样品测定（1）标准曲线表2.5在波长540nm处测定的吸光度值亚硝酸盐浓度（μg/mL）0.00.10.20.40.60.81.0吸光度（A）0.0220.1420.2650.4920.7240.9581.18图2.3亚硝酸盐标准曲线经过计算，得出本方法的线性浓度范围（μg/mL）为：0-1.20；相关系数为：0.999。线性方程为:y=1.148x+0.035,相关系数为0.999。（2）样品测定表2.6线性浓度范围、相关系数、检出限组分线性浓度范围（μg/mL）相关系数检出限（mg/kg）亚硝酸盐0-1.200.9991.00表2.7样品测定结果样品质量（g）9.3349.3329.333吸光度（A）0.0810.0780.080亚硝酸盐含量（mg/kg）3.2643.2633.266经计算样品实验结果的相对标准偏差为：0.15%（3）回收率从实验中选取3个样品，称取重量相等做平行实验，在其中一份定量加入对应实验的标准溶液，测定两者的含量，计算加标回收率。表2.8样品中亚硝酸盐回收率试验样品亚硝酸盐编号本底值µg加入量µg测定值µg回收率（%）138.62057.896.0238.65083.495.6338.6100137.298.6经实验表明，样品的加标回收率达到95%以上，能满足对食品中亚硝酸盐含量的测定。2.2高效液相色谱法2.2.1实验原理是在除去样品中蛋白质和脂肪后，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮反应，再与N-1-萘乙二胺偶合之后，进行色谱分析。若采用反相高效液相色谱法测定酱菜制品中亚硝酸盐的含量，则该方法应选择四丁基溴化铵作为离子对试剂，与亚硝酸盐的阴离子形成中性缔合物，采用甲醇-混合磷酸盐作为流动相，使用非极性键合相柱进行分离并定量检测。2.2.2仪器与试剂甲醇：光谱纯饱和硼砂溶液（50.0g/L）：准确称取5.0g硼酸钠，用热水中溶解，并转移至100mL容量瓶中，放置冷却后，待用。亚铁氰化钾溶液（106.0g/L）：准确称取53.0g亚铁氰化钾，加水溶解并转移至500mL容量瓶中，加水稀释至刻度线，摇匀，待用。醋酸锌溶液（220.0g/L）：准确称取110g醋酸锌加30mL冰乙酸用于水并转移至500mL容量瓶中，加水稀释至刻度线，摇匀，待用。亚硝酸盐标准溶液（200mg/L）：准确称取0.100g的亚硝酸钠放置于硅胶干燥器中干燥24h，干燥完成后加水溶解并转移至500mL容量瓶中，加水稀释至刻度线，摇匀，待用。液相色谱仪：岛津LC-10A型液相色谱仪0.45um微孔滤膜容量瓶：100mL1个500mL3个若干烧杯若干量筒2.2.3实验条件色谱柱：Shim-packCLC-ODSφ6×150mm预柱：Shim-packODS流动相：甲醇一混合磷酸盐溶液，四丁基溴化铵作为离子对试剂流速：1.0mL／min柱温：25℃检测波长：20nm进样量：20μL2.2.4试验步骤（1）样品预处理称取已绞碎混匀的样品5.0g左右，并放置于100mL烧杯中，加入2.5mL硼砂饱和溶液，搅拌均匀。使用70℃左右的蒸馏水将试样转移至500mL容量瓶中。放入沸水浴中加热15分钟，取出后冷却至室温。然后一边摇动容量瓶，一边缓慢加入5mL亚铁氰化钾溶液，摇匀后，再加入5mL醋酸锌溶液，将蛋白质沉淀。加水至刻度线，摇匀，静置片刻。取上层清夜，使用0.45μm滤膜滤过，收集待测。（2）流动相的选择作为流动相的是甲醇-混合磷酸盐溶液，以20:80的比例配，离子对试剂选择四丁基溴化铵。流动相进行初始平衡时因为色谱柱含有离子对试剂的缘故，色谱柱吸收和释放离子对试剂的过程缓慢。所以色谱柱平衡较慢，必须在确保保留值能重现后，方可进行测定。（3）测定在相同的色谱条件下,分别测出样品的色谱图与标准溶液的色谱图，并对照比较。根据色谱峰的保留时间确定，采用峰面积外标法定量。2.2.5液相色谱仪的使用（1）开机准备选择并安装色谱柱和保护柱，选择并过滤流动相，检查储液瓶中的流动相是否足够，检查溶剂过滤器是否插入至瓶底，清空废液瓶，检查排液管管道是否通畅。（2）开机开启稳压电源，待高压红灯亮起后，按顺序依次打开输液泵，柱温箱，紫外检测器和色谱工作站。（3）参数设置打开输液泵电源开关后，待仪器加电自检完毕后，进入操作版面，依次设置流动相流量数值，仪器在上述流量下的最大限压和最小限压。（4）冲洗管道将排液阀旋转至打开，按动purge键，输液泵将以10mL/min流量排除管道气泡，当确认管道内无气泡后，在此按动按扭方可停止冲洗工作。（5）数据分析将六通进样阀转到load的位置，用平通注射器将待测样品注入，转回rnject的位置，同时按动工作站的start键，仪器将开始采集色谱数据，绘制色谱图，待色谱峰完全绘制出后，按下stop键，一起将会停止工作并对数据进行分析，后可进行打印工作。2.2.6数据处理2.2.6.1标准品的色谱图在上述的色谱条件下对标准待测溶液进行测定,得到标准溶液的色谱图,见图2.4。保留时间为10.1min。图2.4液相色谱图2.2.6.2标准曲线的绘制表2.9亚硝酸盐的浓度与峰面积浓度（mg/mL）1521384759峰面积105125171198234图2.5亚硝酸盐标准曲线绘制亚硝酸盐的标准曲线,结果如图2.5所示,在0-80.00μg/mL范围内,峰面积y与浓度x的线性关系良好。线性方程为:y=2.8950x+62.360,相关系数为0.999。2.2.6.3样品测定根据IUPAC的规定倍噪音为样品检出限。该方法的线性范围、相关系数、检出限如表2.10所示。表2.10线性浓度范围、相关系数、检出限组分线性浓度范围（μg/mL）相关系数检出限（mg/kg）亚硝酸盐0-80.000.9990.08表2.11亚硝酸钠含量结果测定次数123平均值亚硝酸盐含量（mg/kg）3.2653.2643.2663.265经计算样品实验结果的相对标准偏差为：0.10%2.2.6.4加标回收率从实验中选取3个样品，称取重量相等做平行实验，在其中一份定量加入对应实验的标准溶液，测定两者的含量，计算加标回收率。表2.12样品中亚硝酸盐回收率试验样品亚硝酸盐编号本底值µg加入量µg测定值µg回收率（%）158.92078.3297.1258.950107.396.8358.9100156.597.6经实验表明，样品的加标回收率达到95%以上，能满足对食品中亚硝酸盐含量的测定。2.3结果与讨论2.3.1实验结果通过盐酸萘乙二胺分光光度法实验得到亚硝酸盐含量C(μg/mL)在540nm波长处有最大吸收峰。标准亚硝酸盐线性范围在0～1.20μg/mL，其线性方程为y=1.148x+0.035，相关系数为0.999，酱菜中所含的亚硝酸盐含量符合国家标准。该方法还具有设备简单、操作快捷、实用、分析结果的准确度符合食品检验的要求。通过高效液相色谱法实验得到酱菜中所含的亚硝酸盐含量符合国家标准，标准亚硝酸盐线性范围在0～80μg/mL，其线性方程为:y=2.8950x+62.360，相关系数为0.999。高效液相色谱具有检测的分辨率和灵敏度高，分析速度快，重复性好，定量精密度高，应用范围广，线性范围大等特点。2.3.2试验方法比较盐酸萘乙二胺法优点是该方法具有应用广泛、灵敏度高、选择性好、准确度高、分析成本低、操作简便、快速的特点。其缺点是只能测定亚硝酸盐，不能同时测其它物质。反相高效液相色谱法具有检测的分辨率高，灵敏度高，分析速度快，重复性好，定量精密度高，应用范围广，线性范围大，常见的食品添加剂均不形成干扰等优点。缺点是所用试剂有毒，对实验人员与环境有危害。相比较而言，反相高效液相色谱法能够同时测定卤肉制品中亚硝酸盐和其他组分的含量，具有快速、准确、灵敏、线性范围大等优点。样品中的其他组分如脂肪、色素、蛋白质等对其检测不构成干扰。并且实验结果与国家标