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DB34DB34/T3208—2018羊传染性脓疮病毒分离鉴定技术规程TechnicalRegulationforIsolationandIdentificationofGoatContagiousEcthymaVirus2018-10-20发布2018-11-20实施安徽省质量技术监督局发布I心1NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技增殖表皮癌细胞（HeLa）、羊睾丸原代细胞（Lambtestiscells，LT）、DMEM培养基、M199液温融解，反复三次。经5000r/min离心10min，取上清，并加入青霉素和链霉素，终浓度为20002养液，用灭菌PBS清洗三次，接种1mL处理好的样品，于5%C02培养箱，37℃下吸附2h,期间每隔30min轻轻摇晃一次。弃去样品液，用灭菌PBS清洗三次，加入5mL细胞维持液(血清含量为2%),培养箱内继续培养5d。在培养过程中每日观察细胞病变(CPE)产生情况，如出现CPE(特征同时设立空白对照(见图1)。A:病变的HeLa细胞；B:对照细胞图1接种后第72小时病变的HeLa细胞和对照细胞10×将胰酶消化液彻底冲洗干净，加入适量生长液(含10%血清的M199培养基),用玻璃珠振荡法分散胞悬液，7mL/瓶(T25细胞培养瓶),置37℃、5%CO₂培养箱中进行培养。用灭菌PBS清洗三次，接种1mL处理好的样品，于5%CO₂培养箱，37℃下吸附1h,期间每隔15min为2%),培养箱内继续培养4d。在培养过程中每日观察CPE产生情况，如出现CPE,收集细胞培同时设立空白对照(见图2)。3A:病变的羊睾丸原代细胞；B:对照细胞B2Lgene上游引物：5’-CGGGATCCATGTGGCCGTTCTCCTCCAT-3’B2Lgene下游引物：5’-CGGAATTCTTAATTTATTGGTTTGCAGAACTCC-3’利用DNA提取试剂盒提取待测样品以及羊痘阳性病料DNA,以此作为PCR扩增模板。PCR扩增反应条件：94℃预变性3min;94℃45s,58℃45s,7性条带(见图3)。2M——DL2000Marker;1——待检样品；2——羊痘阳性病料；3——阴性对照。47.3

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