熊源性成分检测实时荧光PCR法

1熊源性成分检测实时荧光PCR法本文件规定了动物源性产品中熊源性成分实时荧光PCR检测方法。本文件适用于动物源性产品（肉制品、皮毛类产品、饲料等）中熊源性成分的鉴定，灵敏度为0.01ng/μL。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB4789.1食品安全国家文件食品微生物学检验总则GB/T5009.1食品卫生检验方法理化部分总则GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求3缩略语下列缩略语适用于本文件。3.1CTAB十六烷基三甲基溴化铵3.2EDTA乙二胺四乙酸实时荧光定量聚合酶链式反应三氨基甲烷4设备4.1实时荧光PCR检测系统。4.2高速台式冷冻离心机（最高转速12000rpm以上）。24.3离心机。4.4旋涡振荡器。4.5单孔道微量移液器和枪头：0.5μL～10μL、10μL～100μL、20μL～200μL、100μL～1000μL。4.6EP离心管。4.7刻度量筒：100mL，500mL，1000mL。4.8试剂瓶和洗涤瓶：500mL。4.9天平。5试剂与材料5.1水：符合GB/T6682分析实验室二级水规格。5.2试剂盒：按说明书使用试剂盒提供的相应试剂。5.3自备的试剂：CTAB提取缓冲液（十六烷基三甲基溴化铵CTAB-沉淀液，蛋白酶K（1.2mol/L）氯化钠。5.4实时荧光预混液。5.5引物对序列-上游：5’-CTCAGGAATAATTCTACTAACA-3’-下游：5’-GAGCGATTGAAGAGTATG-3’-探针序列：5’-FAM-TCGCACCTCTATCCGTCCTATATCA-TAMRA-3’5.6质控物质5.6.1阳性对照样品：采用已知含有熊源性成分的样品或经测序确认的阳性质粒。5.6.2阴性对照样品：采用已知不含有熊源性成分的样品。5.6.3空白对照：采用与模板等体积的双蒸水。6实验方法6.1样品的选取与制备动物源性食品按照GB/T5009.1和GB4789.1采样。将实验室样品研磨待用。6.2样品DNA的提取3参照附录A中方法提取样品基因组DNA，也可采用商品化的组织基因组DNA提取试剂盒进行。当A260/A280比值在1.7～1.9之间时，适宜于PCR扩增。除检测样品外，需要设立阴性、阳性及空白对照。6.3实时荧光PCR检测6.3.1反应体系反应体系体积为25μL，体系组成见表1。表1熊源性成分实时荧光PCR检测方法的反应体系试剂名称贮备液浓度μmol/L反应体系体积—111—2—6.3.2反应条件预变性：95℃,3min；变性：95℃,15s收集荧光信号值。6.3.3检测过程分别设阴性对照、阳性对照和空白对照。7结果判定与表述7.1质量控制7.1.1一般要求实验中设置的各种对照PCR检测结果应符合以下情况。否则，任一种对照如果出现非下述正常结果，应重做试验。7.1.2核酸提取空白对照和PCR扩增试剂空白对照检测结果Ct≥40.07.1.3PCR扩增阴性目标DNA对照检测结果Ct≥40.07.1.4PCR扩增阳性目标DNA对照4检测结果Ct≤35.07.2结果判断和报告7.2.1样品2个平行样检测结果Ct≥40.0，同时各种试验对照结果正常，可以判断样品结果为阴性，报告未检出熊源性成分。7.2.2样品至少1个平行样检测结果35.0﹤Ct﹤40.0，并出现典型的扩增曲线，同时各种试验对照结果正常，此时应适当增加DNA模板量重做实时荧光PCR检测。再次检测结果仍然Ct﹤40.0并出现典型的扩增曲线，同时各种试验对照结果正常，可以判断样品检出熊源性成分，报告检出熊源性成分；再次检测结果仍然Ct≥40.0同时各种试验对照结果正常，可以判断样品未检出熊源性成分，报告未检出熊源性成分。7.2.3样品2个平行样品检测结果Ct≤35.0并出现典型的扩增曲线，同时各种试验对照结果正常，可以判断样品检出熊源性成分，报告检出熊源性成分。8防止交叉污染措施按照GB/T19495.2防止检测过程中交叉污染。5样品DNA的提取及溶液配制A.1CTAB-提取缓冲液将5gCTAB，20.45gNaCL，3.03gTris，1.86gNa2-EDTA溶于200mL水中，用盐酸调pH8.0后，定容至250mL，115℃高压15min。A.2CTAB-沉淀液称0.2gCTAB，0.234gNaCL，定容至100mL，115℃高压15min。A.3蛋白酶K按试剂说明配制。A.41.2mol/LNaCL溶液称取28gNaCL，定容至400mL，115℃高压15min。A.5DNA提取方法A.5.1称取样品0.5g～1g加入1.5mL～3.5mLCTAB提取液中，再加入12μL～20μL蛋白酶K（根据CTAB量调节），每个样品提取2管，同时用水做空白对照。混匀后65℃至少1h(过夜孵育最好)，如样品膨胀，则可再多加CTAB，每次多1mL，最多10mL。A.5.2低温4000rpm～5000rpm离心10min。A.5.3将上清（约1mL）加入无菌EP中（2mL管），加入700μL氯仿，旋涡30s后，再12000rpm离心10min。A.5.4取上清600μL～650μL加入无菌EP中，加入2倍体积的CTAB沉淀液，旋涡混匀，室温静置1min。A.5.512000rpm离心10min，去上清。沉淀溶解于350μL的1.2mol/LNaCL溶液。（2管合并共用350μL溶液）。A.5.6加入350μL氯仿，涡旋30s，再12000rpm离心10min。A.5.7取上清液至无菌EP管中（确定体积加入0.8倍体积的异丙醇，手摇混匀，室温孵化至少20min,12000rpm离心10min，去上清，沉淀用500μL75%的乙醇洗涤，再12000rpm离心10min。6A.5.8A.5.9去上清后，干燥沉淀，60℃下15s～20s（开盖倒立）。将沉淀溶于100μL灭菌水或TEBuffer或DEPC水中。7熊源性成分的目标扩增序列大小182bpCTCAGGAATAATTCTACTAACATGACAAAAAATCG