DB34∕T 3307-2018 分子标记辅助选择抗稻瘟病基因Pi1、Pi2的检测 PCR法　　

DB34DB34/T3307—2018分子标记辅助选择抗稻瘟病基因Pi1、Pi2Protocolformolecularmarkerassisted-selectionofriceblastresistancegenePi1andPi2PCRmethod2018-12-29发布2019-01-29实施安徽省市场监督管理局发布I1分子标记辅助选择抗稻瘟病基因Pi1、Pi2的检测PCR法本标准规定了分子标记辅助选择抗稻瘟病双基因Pi1和Pi2的PCR检测方法。GB/T6682分析实验室用水规CTAB：cetyltrimethylammoniumbromide，DNA：deoxyribonucleicaciddNTPs：deoxyribonucleosidetriphoPAGE：polyacrylamidegelelectrophoresis，聚PCR：polymerasechainreaction，聚合SSR：simplesequencere和Pi2紧密连锁的分子标记，以及适用于对连锁标记检测结果进行验证和水稻品种中稻瘟病抗源基因的DNA，利用筛选的特异性检测引物对样品DNA进行PCR扩增，依据是否扩增获得预期大小的DNA2高压灭菌锅、超纯水仪、高速离心机、恒温水浴锅（30℃~100℃)、核酸蛋白测定仪、组织研磨去离子甲酰胺、溴酚蓝、二甲苯青FF、丙烯酰胺、取待检样品的去壳种子、幼苗或叶片约200～300mg置于2.0mL离心管，充分研磨；每管700µL经65℃预热的CTAB提取液，充分混合，65℃水浴30mi弃上清液，用70％乙醇溶液洗涤2遍；室温自然晾干后，加入超纯水或T将种子发芽至幼苗长度达到3cm左右时剪取0.5cm长的幼苗，或将田间植株的叶片剪取0.53本标准针对抗稻瘟病基因Pi1和Pi2分别筛选出两对检测引物（见表1），包括与抗稻瘟病基因表1检测抗稻瘟病基因Pi1和Pi2的引物序列和扩增产物片段大小Pi1Pi2扩增产物加入2L上样指示剂后于4℃保存。涂有剥离硅烷的一面朝下盖于无凹槽玻璃板上，两侧对称拔下玻璃板上的样品梳，用清水洗净点样槽，再将玻璃板装上电泳槽，上下槽4针对连锁标记两重PCR扩增产物的检测，若样本量大（多于96个样品），进行两道电泳，即每断开电源，第二次点样96个（包括两个对照样品），2000一次性可检测96×2=192个不同样品（含2×2=4个对照样品）的抗稻瘟病基因Pi1和Pi2的等位基出，在清水中漂洗1分钟左右；最后取出胶板，晾干，放在胶片观察灯下观察，长度的PCR扩增产物，则可判断检测样品中不含有相应的抗稻瘟病基因；如可扩增出与阳性对照物电泳谱带与含有抗稻瘟病基因Pi1或Pi2的阳性对照相同时，基因型记为Pi1/Pi2纯合导入，与阴性对照相同时，基因型记为Pi-1/Pi-2无导入，同时具有阳性对记为Pi1/Pi2杂合导入。明含有Pi1抗性基因；无扩增产物的，证明不含Pi1抗性基因。用P的样品，证明含有Pi2抗性基因；扩增出不同片段长度产物的，证明不含Pi2抗性基因。5用TE缓冲液1（或超纯水）分别配制正向A.3.140％PAGE胶6A.3.24％PAGE胶A.3.3亲和硅烷工作液A.3.55×TBE缓冲液A.3.60.5×TBE缓冲液7原浓度终浓度体积ddH2O--10×Buffer10×1×1MgCl225mmol/L2.5mmol/L1dNTP2.5mmol/L0.2mmol/LTaq酶5U/L0.5UP1-1引物5mol/L0.25mol/LP2-1引物5mol/L0.25mol/LDNA2原浓度终浓度体积ddH2O--10×Buffer10×1×1MgCl225mmol/L2.5mm