SYB509注射液制造和检定规程

申请分类：新药申请

注册分类：治疗用生物制品2类

SYB509注射液(lOOmg(lOml)/

瓶)制造和检定规程

SYB509注射液资料13

目录

第一部分制造和检定规程.................................................1

1.基本要求..........................................................1

2.制造.............................................................1

2.1工程细胞....................................................1

2.2原液制备...................................................4

2.3半成品.....................................................12

2.4成品......................................................13

3.检定............................................................14

3.1原液检定...................................................14

3.2半成品检定.................................................19

3.3待包装品、成品检定........................................21

4.保存、运输及有效期..............................................26

5.使用说明........................................................26

6.生产单位........................................................26

7.相关文件........................................................27

第二部分制造和检定规程起草说明.......................................28

1.蛋白含量........................................................28

1.1凯氏定氮蛋白浓度测定.......................................28

1.2同类产品消光系数测定......................................29

1.3SYB509注射液样品消光系数测定............................29

2.SYB509注射液抗体溶液（制剂缓冲液）密度的标定..................30

3.动物来源原料相关的检测..........................................31

第二部分检定方法验证资料.............................................32

1.无菌检查法分析方法验证资料......................................32

2.细菌内毒素分析方法验证资料......................................38

3.体积排阻液相色谱法聚合体杂质含量及单体纯度测定验证资料..........51

SYB509注射液资料13

4.还原毛细管电泳IgG纯度分析方法验证资料.........................68

5.UV法蛋白含量测定方法验证资料..................................92

6.离子交换液相色谱法电荷异质体分布检测验证资料...................105

7.毛细管等电聚焦分析方法验证资料.................................118

8.非还原毛细管电泳IgG片段分析方法验证资料......................133

9.生物活性检测方法验证资料.......................................157

10.结合活性分析方法验证资料......................................166

SYB509注射液资料13

表目录

表1SYB509注射液制剂处方......................................12

表2二批同类产品消光系数测定....................................29

表3SYB509注射液样品消光系数测定..............................29

SYB509注射液资料13

第一部分制造和检定规程

本品（SYB509注射液）系由稳定转染并可表达程序性死亡受体1（Programmed

Death1,PD-1）全人源单克隆抗体重组质粒的中国仓鼠卵巢细胞，经细胞培养、分

离和高度纯化后获得的重组抗PD-1全人源单克隆抗体RecombinantantiPD-1human

monoclonalantibody）制成，不含防腐剂和抗生素。

1.基本要求

SYB509注射液属于人用重组单克隆抗体制品，具有复杂的质量属性，在充分了

解制品质量属性的基础上确定制品关键质量属性，以“质量源于设计"‘风险评估”的原

则和理念，制定相应的质量控制策略，并通过建立有效的”质量管理体系"，保证制品

质量可控。人用重组单克隆抗体制品的制造主要包括基因克隆、表达载体的制备、

工程细胞的筛选及细胞库的建立、细胞培养及收获、目的蛋白的提取、纯化和制剂

等过程。

生产过程中使用的原材料和辅料应符合相关质量标准。细胞株的来源、管理及

检定应符合"生物制品生产检定用动物细胞基质制备及检定规程"的相关要求。生

产质量管理应符合中国现行《药品生产质量管理规范》的要求。

2.制造

2.1工程细胞

2.1.1工程细胞名称及来源

重组抗PD-1全人源单克隆抗体工程细胞，系带有该单抗轻、重链基因的重组质

粒转染的CHO-K1细胞，细胞株名称为重组抗PD-1全人源单克隆抗体工程细胞，细

胞克隆号509/A1-F7。

2.1.2细胞库建立、传代及保存

经筛选鉴定可高表达目的蛋白的CHO-K1细胞，在含有筛选剂的无血清培养基

资料13SYB509注射液

扩增后，冻存于液氮中，建立主细胞库:建立的主细胞库每支细胞数不少于IO7个，

每批不少于50支。从主细胞库复苏细胞，传代、扩增后冻存于液氮中，作为工作细

胞库。工作细胞库每支细胞数不少于IO,个，每批不少于100支。从主细胞库至建立

工作细胞库的过程中每次传代不超过12代或培养时间不超过30天（每个倍增为1

代，下同〉工作细胞库细胞复苏后用于生产的最高限定代次为45代。细胞库冻存

于液氮中，冻存液为含约8%二甲基亚枫的无血清培养液，不含有动物来源成分及筛

选剂。主细胞库和工作细胞库经检定合格后均可用于生产。

主细胞库和工作细胞库应分别存放。

2.1.3主细胞库及工作细胞库细胞的检定应符合《中华人民共和国药典》生物制品

通则”生物制品生产检定用动物细胞

基质制备及检定规程"的规定。

2.1.3.1细胞鉴别试验应用生物化学方法（同工酶分析法）进行鉴别，应为典型

仓鼠来源细胞。

2.1.3.2细菌、真菌检查

参考《中华人民共和国药典》微生物检查法1101"无菌检查法"中薄膜过滤法

进行，应符合规定。

2.1.3.3分枝杆菌检查

参考《中华人民共和国药典》微生物检查法1101"无菌检查法”对主细胞库进

行分枝杆菌检查，应符合规定。

2.1.3.4支原体检查

参考《中华人民共和国药典》微生物检查法3301”支原体检查法"或"荧光

定量PCR法"检验，应符合规定。

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SYB509注射液资料13

2.1.3.5病毒检查

细胞内、外源病毒检查参考《中华人民共和国药典》生物制品通则中“生物制

品生产检定用动物细胞基质制备及检定规程"对主细胞库进行检验，细胞外源病毒

检查参考《中华人民共和国药典》生物制品通则中“生物制品生产检定用动物细胞

基质制备及检定规程"对工作细胞库进行检验，应符合规定。

2.1.4工程细胞库的传代稳定性研究

2.1.4.1基因水平稳定性

2.1.4.1.1基因组目的序列

对主细胞库和工作细胞库进行基因组PCR扩增目的序列并测序，轻链和重链的

目的基因组序列应与理论序列一致。

2.1.4.1.2插入基因拷贝数

对主细胞库和工作细胞库进行基因组荧光定量PCR,插入基因拷贝数应维持稳

定水平。

2.1.4.2转录水平稳定性

2.1.4.2.1cDNA序歹U测定

对主细胞库和工作细胞库总RNA进行PCR扩增目的序列并测序，轻链和重链

的目的cDNA序列应与理论序列一致。

2.1.4.2.2mRNA相对水平

对主细胞库和工作细胞库进行总RNA荧光定量PCR,轻、重链mRNA应维持

稳定水平。

2.1.4.3表达水平稳定性

对主细胞库和工作细胞库不同阶段在摇瓶中进行Fed-Batch培养，培养上清进行

蛋白表达量测定，15P应不小于1.0g/L:45P应不小于0.7g/Lo取主细胞库和工作细

胞库对数生长期的培养上清进行PCD检测，比较工程细胞库不同阶段表达量的稳定

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资料13SYB509注射液

性，应不小于10pg/(cell*d)o

2.2原液制备

细胞培养依次为摇瓶多级扩增一种子反应器单/多级扩增一生产反应器培养，生

产反应器培养模式采用Fed-Batch培养。细胞培养全过程应严格按照无菌操作，从

工作细胞复苏至上清收获，细胞倍增不得超过45代。

2.2.1培养基

用于SYB509注射液生产的培养基为无血清培养基，不含有动物来源的蛋白或

其它动物源性大分子成分。培养基主要成分为无机盐、葡萄糖、氨基酸、维生素

类、微量元素、脂肪酸、植物蛋白水解物、重组人膜岛素等。

2.2.2细胞培养

细胞培养依次为摇瓶多级扩增一种子反应器单/多级扩增一生产反应器培养，生

产反应器培养模式采用Fed-Batch培养。

2.2.2.1种子细胞复苏

自主细胞库或工作细胞库取出1支冻存细胞，置37c水浴，并不断振摇，至

完全融化。取1支离心管，加入培养基适量，将融化后的细胞悬液移入离心管中，

室温低速离心5分钟，弃上清，细胞沉淀用少许培养基重悬。取摇瓶加入培养基适

量，将细胞悬液移入。摇瓶置于二氧化碳摇床中振荡培养，二氧化碳摇床参数设定：

37C,120±50rpm,C02浓度2~10%。

细胞库细胞复苏后，于摇瓶中用无血清培养基进行传代和扩增，供下级生物反

应器接种用。

2.2.2.2一级种子扩增复苏的细胞利用摇瓶逐级进行扩增培养，并依据后一级生物

反应器接种的要求

调整细胞密度和种子液体积，摇瓶培养扩增过程中细胞密度应控制在0.3~6.0xl()6

个/ml。摇瓶置于二氧化碳摇床中振荡培养，二氧化碳摇床参数设定:37C,120±50

rpm,CO2浓度2~10%。

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SYB509注射液资料13

2.2.2.3后续种子扩增可以为单级反应器种子培养，也可以多级反应器种子培养，

取决于生产用反应器的规模，一般放大比例为1:37:6。

2.2.2.3.1二级种子扩增

种子要求:采用摇瓶种子时，要求细胞密度为L5~6.0xl()6个局1,细胞活率大于

90%,接种后活细胞密度0.3~L5xl()6个/mi：若采用正在培养的另一个一级种子反应

器接种，则要求细胞活率大于85%,接种后活细胞密度0.5~2.0xl()6个/mi：

培养方式:补料批次或连续灌注培养，直至细胞密度和活率达到供种要求：设定

温度:37C:pH:6.6~7.2,通过CO2和2mol/L的碳酸纳或8%碳酸氢纳对pH进行调控:

通气方式:表层、无泡和(或)微泡通气，控制溶氧，保持细胞培养悬液中溶

解氧饱和度不低于10%:

当二级种子细胞密度不小于1.5x106个的1,细胞活率不低于85%时，经显微镜

镜检无异常，可用于供种下级种子扩增。

2.2.2.3.2二级种子扩增根据需要，可以存在多级后续反应器种子扩增培养，种子

应来源于前级或同级种子反应器，其他相应要求与一级反应器种子相同。

2.2.2.4生产反应器细胞培养

2.2.2.4.1细胞培养工艺条件

接种要求:种子细胞活率不低于85%,接种后活细胞密度应为0.3-1.5X106个/ml。

允许使用1个或2个反应器种子向一个生产用反应器接种，但2个种子反应器的细

胞必须来源于同1支冻存细胞:设定温度:33~37℃:

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资料13SYB509注射液

pH:值6.6~7.2,通过CO2和2moi/L的碳酸纳或8%碳酸氢纳对pH进行调控：

搅拌转速:根据设备情况，应满足细胞悬浮及气体有效传质：通气方式:微泡通

气、表层通气，控制溶氧，保持细胞培养悬液中溶解氧饱和度大于10%o

2.2.2A.2生产反应器细胞培养终点判定

生产反应器自接种至收获正常培养周期为10~16天。若发生下列任何一种情况，

则细胞培养终止：

镜下可见明显微生物生长：

细菌内毒素大于50EU/ml:

设备故障：细胞活率小于30%:

培养第10天活细胞密度小于1.0x106个/ml：

在工艺规程规定时间内细胞密度或蛋白表达量无法达到收获的要求。由前两种原

因（污染）号起的异常终止，培养液经灭活后排放:由其它原因引起的异常终止，应分析

原因，按偏差处理并通过风险评估确认是否影响最终产品质量，如确定不影响最终的

产品质量，细胞培养液可进入下一工序。

2.2.2.5收获及后处理

正常的培养周期为10~16天，在正常的培养周期中，根据细胞培养终点判定要

求，确定收获。

收获的细胞培养悬液通过高速离心串联深层过滤或单独深层过滤进行澄清，收

集滤出液，滤出液浊度应不大于30NTU。

深层过滤滤出液储存于清洁容器中，用于粗纯。

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SYB509注射液资料13

2.2.2.6细胞培养过程中的监控项目、方法及检测频度

活细胞密度及细胞活率:显微镜检。检测频度，细胞培养全程至少每3天取样

检测，种子扩增进入下一级前取样检测，生产反应器在培养至第10天需取样检测。

葡萄糖含量:葡萄糖氧化酶法。检测频度，细胞培养全程至少每3天取样检测，

种子扩增进入下一级前取样检测，生产反应器在培养至第10天需取样检测。

微生物污染:显微镜检。检测频度，细胞培养全程至少每3天取样检测，种子

扩增进入下一级前取样检测，生产反应器在培养至第10天需取样检测。细菌内毒素:

细菌内毒素检查法。检测频度，种子扩增过程每一级种子至少取样检测一次，生产反

应器培养过程至少取样检测2次。

目的蛋白表达量:生产反应器细胞培养过程中采用“rProteinA法上清表达量测定

法”检测培养上清中目的蛋白表达量，从第7天开始，至少每3~5天检测一次。

2.2.2.7细胞培养生产操作要点及注意事项

2.2.2.7.1种子

复苏以后，接种于生产用生物反应器培养之前的所有在摇瓶或生物反应器中培

养的细胞，均可称为种子。各级种子在培养过程中都应保持在合适的活细胞密度

和活率范围内。

2.2.2.7.2培养时间在细胞扩增过程中，可以选择前级或同级培养细胞作为种子来

源，在选择的过程中必须保证整个培养时间在要求的范围内。

2.2.2.7.3种子转移细胞培养的级别划分为多个级别:种子复苏、摇瓶种子液制备，

一级或多级反应器种子培养，生产用生物反应器培养。当上一级或同级细胞

的活细胞密度、活率满足接种要求时，即可作为种子进行接种。种子不限于

仅接种下一级细胞培养，也可以为同级细胞培养供种。

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资料13SYB509注射液

2.2.2.7.4无菌

细胞培养的全过程均需严格无菌操作，防止外源性细菌、病毒等污染，避免

增加微生物负荷。

2.2.3分离纯化

深层过滤滤出液经重组蛋白A亲和层析，低pH孵育灭活病毒，澄清过滤，再

经离子交换层析、疏水层析、除病毒过滤、超滤浓缩、缓冲液置换及降低生物负

荷过滤等纯化步骤，制得的SYB509原液，使其达到本规程3.1项要求。

2.2.3.1重组蛋白A亲和层析

填料为重组蛋白A亲和层析介质，上样载量不超过每升介质28克蛋白。

2.2.3.1.1柱平衡

平衡液（20mmol/L磷酸缓冲液+150mmol/L氯化纳，pH:6.60~7.40）平衡层析

柱至流出液紫外基线走平，流速为60~160cm/h,压力不高于2bar。

2.2.3.1.2上样

滤出液过柱上样，流速为60-160cm/h,压力不高于2bar。

2.2.3.1.3上样后平衡

平衡液（20mmol/L磷酸缓冲液+150mmol/L氯化纳，pH:6.60~7.40＞冲洗层析

柱至流出液紫外回基线，流速为60-160cm/h,压力不高于2bar。

2.2.3.1.4洗脱

洗脱液（25mmol/L拘橡酸，pH:3.30~3.70）过柱洗脱。流速为60-160cm/h,压

力不高于2bar»收集入280处有紫外吸收的流出峰，即为“亲和层析洗脱峰"。洗脱峰

收集后立即取样、密封、贴签，2~8c暂存。

2.2.3.1.5再生

再生液（0.1mol/L磷酸）再生不少于3个柱体积，流速为60-160cm/h,压力不高

于2bare

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SYB509注射液资料13

2.2.3.1.6柱清洗消毒

消毒液(O.lmol/L氢氧化纳+l.Omol/L氯化纳)消毒不少于1.5个柱体积，流速

为60-160cm/h,压力不高于2bar。

2.2.3.1.7柱保存

柱清洗消毒后用平衡液(20mmol/L磷酸缓冲液+150mmol/L氯化纳，pH:

6.60~7.40)平衡至层析柱pH为中性，保存于2%苯甲醇+0.1mol/L醋酸纳中。

2.2.3.2低pH孵育

检测”亲和层析主峰"，pH应为3.5~3.8,否则用调节液(500mmol/L拘橡酸，

pH:3.3O~3.7O或lmol/LTris)调节。控制温度为室温(18~25C),孵育不少于1小

时，不超过12小时。

2.2.3.3阳离子交换层析

填料为磺酸基(S-)阳离子交换层析，上样载量不超过每升介质65克蛋白。

2.2.3.3.1样品处理一澄清过滤

向孵育后的亲和层析主峰"中缓缓加入1mol/LTris,至最终pH值为4.90-5.10,

昆匀后放置30分钟，进行澄清过滤，待用。

2.233.2柱平衡

以注射用水冲洗层析柱，然后按顺序以再生液(20mmol/LNaAc-HAc+lmol/L

NaCl,pH:4.80~5.20)和平衡液(20mmol/LNaAc-HAc,pH:4.90~5.10)平衡层析柱至柱

前后电导pH值一致且各溶液不少于2个柱体积。流速为100~250cm/h,压力不高

于2bar。

2.2.3.3.3上样

处理后样品上样。流速为100~250cm/h,压力不高于2bar。

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资料13SYB509注射液

2.2.3.3.4上样后平衡、洗涤

以平衡液(20mmol/LNaAc-HAc,pH:4.90~5.10)过柱至流出液紫外回归基线走

平且不少于2个柱体积。流速为100~250cm/h,压力不高于2bar。

2.2.3.3.5洗脱

洗脱液(20mmol/LNaAc-HAc+250mmol/LNaCl,pH:4.90~5.10),过柱洗脱，

流速为100~250cm/h,压力不高于2bar。洗脱开始立即收集九280处有紫外吸收的流出

峰。收集后立即取样、密封、贴签，即为‘阳离子交换层析主峰”。于2~8℃暂存。

2.2.3.3.6再生

用再生液(20mmol/LNaAc-HAc+lmol/LNaCbpH:4.80~5.20)再生层析柱不少

于2个柱体积，流速为100~250cm/h,压力不高于2bar。紫外吸收峰为杂峰，只监

测紫外吸收峰高度。

2.2.3.3.7消毒

消毒湎).5mol/L氢氧化纳消毒层析柱不少于3个柱体积,流速为100~250cnVh,

压力不高于2bar。

2.2.3.3.8柱保存

层析柱清洗消毒后室温保存于0.lmol/L氢氧化纳溶液中，大于4周以上保存时

使用20%乙醇溶液或更换新的0.lmol/L氢氧化纳溶液。

2.2.3A疏水层析

填料为苯基疏水层析介质，上样载量不超过每升介质25克蛋白。

2.2.3.4.1样品处理

向"阳离子交换层析主峰"中缓缓加入0.30倍体积的电导调节液(3

mol/L(NH4)2SO4>至最终(NH^SCU浓度为0.7mol/L,昆匀，待用。

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SYB509注射液资料13

2.2.3A.2柱平衡

用注射用水冲洗层析柱后以平衡液(10mmol/LPB+1.0mol/L(NHQ2SO4,pH:

6.80~7.20)平衡层析柱，平衡不少于2个柱体积至柱前后电导一致。流速为

80~250cm/h,压力不高于2bar。

2.2.3.4.3上样

处理后样品上样。流速为80~250cm/h,压力不高于2bar。

2.2.3.4A上样后平衡

以平衡液(10mmol/LPB+1.0mol/L(NH4)2SO4,pH:6.80~7.20)过柱平衡不少

于3个柱体积至流出液紫外回归基线并走平。流速为80~250cm/h,压力不高于2bar。

2.2.3.4.5洗脱1

洗月兑液1(10mmol/LPB+0.2moi/L(NH4)2SO4,pH:6.80~7.20),过柱洗脱，流

速为80~250cm/h,压力不高于2bar。收集九280处有紫外吸收的流出峰。收集后立即

取样、密封、贴签，即为"疏水层析主峰"。于2~8c暂存。

2.23.4.6洗脱2

洗脱液2(10mmol/LPB,pH:6.80~7.20)过柱洗脱不少于2个柱体积，洗脱流

速80~250cm/h,压力不高于2bar。洗脱峰为杂峰，只监测紫外吸收峰高度。

2.23.4.7柱消毒

消毒液0.5mol/L氢氧化纳艄毒层析柱不少于3个柱体积，流速为80~250cm/h,

压力不高于2bar。

2.2.3.4.8柱保存

层析柱清洗消毒后室温保存于O.lmol/L氢氧化纳溶液中，大于4周以上保存时

使用20%乙醇溶液或更换新的O.lmol/L氢氧化纳溶液。

2.2.3.5除病毒过滤、超滤疏水层析洗脱峰用经过缓冲液润湿的除病毒滤膜过滤，再用

截留分子量30KD、50KD超滤膜包的超滤膜对目的蛋白溶液进行超滤浓缩和缓冲液置

换，加入甘露醇至30.00g/L＞聚山梨醋80跳注射用)至0.20g/L,依地酸二纳二水合物)

至0.0074g/L,再经降低生物负荷过滤，即得原液。

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资料13SYB509注射液

2.2.3.6保存条件

原液应存放于-18C以下，有效期暂定为24个月。

2.2.3.7原液检定

按3.1项进行。

2.3半成品

231配制与除菌采用符合《中华人民共和国药典》标准的辅料，根据下表的制剂

配方，计算所需的制剂辅料用量，配制稀释液。

表1SYB509注射液制剂处方

组份*含hl浓度

SYB509100mgWg/L

聚山梨醋80（供注射用）2mg0.2g/L

拘橡酸纳（二水合物）51.6mg5.16g/L

无水拘橡酸*4.7mg0.47g/L

氯化纳（供注射用）29.2mg2.92g/L

甘露醇300mg30g/L

依地酸二纳（二水合物）0.074mg0.0074g/L

*若选用不同结晶水合物或无水合物，需要折算为与上表中等物质的量浓度。

SYB509注射液采用中性棚硅玻璃管制注射剂瓶包装，每瓶10ml,pH:5.7~6.3。

半成品配制后立即进行除菌过滤。

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SYB509注射液资料13

2.3.2半成品检定

按3.2项进行。

2.4成品

2.4.1分批

应按照《中华人民共和国药典》生物制品通则"生物制品分批规程"分批，规

定产品批号。

2.4.2分装

应符合《中华人民共和国药典》生物制品通则“生物制品分装和冻干规程”及制剂

通则0102注射剂有关规定。除菌过滤后的半成品应及时分装。

2.4.3规格

1OOmg(10ml)/瓶o

2.4.4包装

应符合《中华人民共和国药典》生物制品通则”生物制品包装规程"及制剂通

则0102注射剂有关规定。

2.4.5成品检定

按3.3项进行。

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资料13SYB509注射液

3.检定

3.1原液检定

3.1.1鉴别与一致性分析

3.1.1.1等电点

方法:毛细管等电聚焦电泳测定法（毛细管等电聚焦电泳分析标准操作规程

SOP-QC-OPE-050）

参考《中华人民共和国药典》"毛细管等电聚焦电泳法I通则0542）测定标

准报告主峰pl值:与参比品比较，主峰pl差异应在土0.1以内。

3.1.1.2肤图

方法:肤图谱测定法（509还原民基化法UPLC肤图分析标准操作规程

SOP-QC-509-012）

采用还原、竣甲基化、膜蛋白酶水解及反相UPLC法测定

标准应与参比品一致

3.1.1.3电荷异质体分布

方法:电荷异质体分布测定法509离子交换液相色谱法电荷异质体分布检测标准

操作规程SOP-QC-509-010）

阳离子交换UPLC分析标准

主峰相对参比品保留时间应为0.90~1.10:样品图谱应与参比品一致

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SYB509注射液资料13

3.1.1.4糖基化修饰分析

方法:糖基化修饰分析测定法（509亲水作用液相色谱法寡糖分布检测标准操作规

程SOP-QC-509-013）

PNGaseF酶切，2-AB标记，UPLC分析标准高甘露糖糖型比例应不大于10.0%。

3.1.2纯度和杂质

3.1.2.1毛细管电泳纯度

方法:毛细管电泳纯度测定法509毛细管电泳IgG纯度异质体分析标准操作规

程SOP-QC-509-011）

毛细管电泳法标准

非还原:应与参比品一致还原:按峰面积归一化法计算，轻重链峰面积之和应

不小于95.0%

3.1.2.2体积排阻液相色谱纯度方法:体积排阻液相色谱测定法（体积排阻液相色谱法

标准操作规程SOP-QC-OPE-005）

参考《中华人民共和国药典》"高效液相色谱法'【通则0514）测定。采用分子筛

液相色谱分析，检测波长280nm

标准：按峰面积归一化法计算，聚合体峰面积之和应不大于3.0%,单体峰面积

应不小于97.0%o

15

资料13SYB509注射液

3.1.2.3电荷异质体分布

方法:电荷异质体分布测定法509离子交换液相色谱法电荷异质体分布检测标准

操作规程SOP-QC-509-010）

阳离子交换UPLC分析

标准：按峰面积归一化法计算，酸性变异体峰面积之和应不大于40.0%,报告主峰

峰面积，报告碱性变异体峰面积之和。

3.1.2.4宿主细胞蛋白质

方法:宿主细胞蛋白残留量测定法（CHO宿主细胞蛋白残留量测定标准操作规程

SOP-QC-OPE-018）；

酶联免疫法测定；

标准：应不大于总蛋白的100ppm；

3.1.2.5宿主细胞DNA

方法:宿主细胞DNA残留量测定法（RT-PCR法CHODNA残留量测定标准操

作规程SOP-QC-OPE-061）；

荧光定量PCR法测定；

标准：应不大于10pg/mg蛋白。

3.1.2.6蛋白A

方法:重组蛋白A残留量测定法（蛋白A残留量测定标准操作规程SOP-QC-

OPE-019）

16

SYB509注射液资料13

酶联免疫法检测

标准：应不大于总蛋白的100Ppm。

3.1.3效价

3.1.3.1生物活性

方法:生物活性测定法（509生物活性测定标准操作规程SOP-GE-509-001）

报告基因法

标准：与参比品比较，相对生物活性应为70%~130%

3.1.3.2结合活性

方法:结合活性测定法（509结合活性测定标准操作规程SOP-GE-509-002）

固相化PD-1结合活性

标准：与参比品比较，相对结合活性应为70%~130%

3.1.4蛋白含量

方法:紫外法蛋白质含量测定法（UV法蛋白含量测定标准操作规程

SOP-QC-OPE-OOl）

用紫外法测定，消光系数e=1.68L/（g-cm）

标准：应不小于10.0g/L

17

资料13SYB509注射液

3.1.5其他检定

3.1.5.1pH值

方法：参考《中华人民共和国药典》”pH值测定法丫通则0631）测定

标准：应为5.7~6.3

3.1.5.2渗透压摩尔浓度

方法：参考《中华人民共和国药典》"渗透压摩尔浓度测定法'【通则0632）测定

标准：应为290~350mosmol/kg

3.1.5.3细菌内毒素检查方法：参考《中华人民共和国药典》"细菌内毒素检查法’（通

则1143方法1）进行；

标准：应小于0.50EU/mg蛋白。

3.1.5.4聚山梨醋80含量

方法:聚山梨醋80含量测定法（UV-VIS法聚山梨醋80含量测定标准操作规程

SOP-QC-OPE-028）

标准:应为0.14~0.26g/L。

18

SYB509注射液资料13

3.1.5.5微生物限度

方法：参考《中华人民共和国药典》"非无菌产品微生物限度检查:微生物计

数法'（通则1105薄膜过滤法）进行；

标准：需氧菌总数应不大于ICFU/ml

霉菌、酵母菌总数应不大于ICFU/mlo

3.2半成品检定

3.2.1蛋白含量

方法:紫外法蛋白质含量测定法（UV法蛋白含量测定标准操作规程

SOP-QC-OPE-OOl）用紫外法测定，消光系数£=1.68L/（g-cm）

标准：应为9.00~11.00g/L

3.2.2体积排阻液相色谱纯度方法:体积排阻液相色谱测定法（体积排阻液相色谱法标

准操作规程SOP-QC-OPE-005）

参考《中华人民共和国药典》"高效液相色谱法'【通则0514）测定。采用分子筛

液相色谱分析，检测波长280nm

标准

按峰面积归一化法计算，聚合体峰面积之和应不大于3.0%,单体峰面积应不小

于97.0%

19

资料13SYB509注射液

3.2.3pH值

方法参考《中华人民共和国药典》”pH值测定法Y通则0631）测定

标准应为5.8~6.2。

3.2.4细菌内毒素检查

方法参考《中华人民共和国药典》"细菌内毒素检查法'【通则1143方法1）进行;

标准应小于0.50EU/mgo

3.2.5无菌检查

方法参考《中华人民共和国药典》"无菌检查法’【通则1101薄膜过滤法）进行；

标准应无菌生长。

20

SYB509注射液资料13

3.3待包装品、成品检定

3.3.1鉴别与一致性分析

3.3.1.1等电点

方法:毛细管等电聚焦电泳法（毛细管等电聚焦电泳分析标准操作规程

SOP-QC-OPE-050）

参考《中华人民共和国药典》"毛细管等电聚焦电泳法1通则0542）测定标准

报告主峰pl值:与参比品比较，主峰pl差异应在土0.1以内。

3.3.1.2电荷异质体分布

方法:电荷异质体分布测定法（509离子交换液相色谱法电荷异质体分布检测标准

操作规程SOP-QC-509-010）

阳离子交换UPLC分析

标准：主峰相对参比品保留时间应为0.90~1.10:样品图谱应与参比品一致

3.3.2纯度和杂质

3.3.2.1毛细管电泳纯度

方法:毛细管电泳纯度测定法509毛细管电泳IgG纯度异质体分析标准操作规

程SOP-QC-509-011）毛细管电泳法；

标准：

非还原:应与参比品一致；

还原:按峰面积归一化法计算，轻重链峰面积之和应不小于95.0%o

21

资料13SYB509注射液

3.3.2.2体积排阻液相色谱纯度方法:体积排阻液相色谱测定法（体积排阻液相色谱法

标准操作规程SOP-QC-OPE-005）

参考《中华人民共和国药典》"高效液相色谱法'【通则0514）测定。采用分子筛

液相色谱分析，检测波长280nm

标准

按峰面积归一化法计算，聚合体峰面积之和应不大于3.0%,单体峰面积应不

小于97.0%

3.3.2.3电荷异质体分布

方法:电荷异质体分布测定流509离子交换液相色谱法电荷异质体分布检测标

准操作规程SOP-QC-509-010）阳离子交换UPLC分析

标准

按峰面积归一化法计算，酸性变异体峰面积之和应不大于40.0%,报告主峰峰面

积，报告碱性变异体峰面积之和。

3.3.3效价

3.3.3.1生物活性

方法:生物活性测定法（509生物活性测定标准操作规程SOP-GE-509-001）

报告基因法；

标准：与参比品比较，相对生物活性应为70%~130%。

22

SYB509注射液资料13

3.3.3.2结合活性

方法:结合活性测定法（509结合活性测定标准操作规程SOP-GE-509-002）

固相化PD-1结合活性；

标准：与参比品比较，相对结合活性应为70%~130%。

3.3.4含量

方法:紫外法蛋白质含量测定法（UV法蛋白含量测定标准操作规程

SOP-QC-OPE-OOl）用紫外法测定，消光系数£=1.68L/（gtm）;

标准：应为9.00~11.00g/L。

3.3.5其他检定

3.3.5.1外观及性状

方法

参考《中华人民共和国药典》"溶液颜色检查法'【通则0901第一法）及"澄

清度检查法'【通则0902第二法）进行

标准

应为无色至微黄色液体，颜色应不深于黄色2号（Y-2）标准液:浊度应不浓于3号

浊度标准液。

33.5.2pH值

方法：参考《中华人民共和国药典》"pH值测定法I通则0631）测定；

标准：应为5.7~6.3。

23

资料13SYB509注射液

3.3.5.3渗透压摩尔浓度方法：参考《中华人民共和国药典》"渗透压摩尔浓度测定

法'【通则0632）测定

标准应为290~350mOsmol/kgo

3.3.5.4装量

方法：参考《中华人民共和国药典》”装量'【通则0102）检查进行；

标准：每瓶均应不小于10.0ml。

3.3.5.5不溶性微粒

方法：参考《中华人民共和国药典》"不溶性微粒检查法'【通则0903第

一法"光阻法’）进行；

标准：每瓶中三lOpim的微粒数应不大于6000粒：每瓶中三25叩1的微粒数应不大

于600粒。

3.3.5.6可见异物

方法：参考《中华人民共和国药典》'可见异物检查法通则0904第一法，灯

检法》进行；

标准：应无明显可见异物:微细可见异物初试检出数应不大于1瓶，如复试，

初、复试检出数应不大于2瓶。

24

SYB509注射液资料13

3.3.5.7无菌检查

方法：参考《中华人民共和国药典》"无菌检查法’【通则1101薄膜过滤法）进行

标准：应无菌生长。

33.5.8细菌内毒素检查

方法

参考《中华人民共和国药典》“细菌内毒素检查法，［通则1143方法1）进行

标准

应小于0.50EU/mg

33.5.9异常毒性检查

方法

参考《中华人民共和国药典》"异常毒性检查法’【通则1141小鼠实验法）进

行

标准

连续观察7天，小鼠应全部健存，且无异常反应，到期时每只小鼠体重应增加

25

资料13SYB509注射液

3.3.5.10聚山梨醋80含量

方法:聚山梨醋80含量测定法（UV-VIS法聚山梨醋80含量测定标准操作规程

SOP-QC-OPE-028）

标准：应为0.14~0.26g/L

4.保存、运输及有效期

2~8c避光保存和运输。

有效期暂定为24个月。

5.使用说明

应符合《中华人民共和国药典〉2015年版）生物制品通则，生物制品包装规程"

规定和批准的内容。

应符合《药品说明书和标签管理规定》的相关内容。

6.生产单位

XX生物技术有限公司

26

SYB509注射液资料13

7.相关文件

毛细管等电聚焦电泳分析标准操作规程SOP-QC-OPE-050509

还原民基化法UPLC肤图分析标准操作规程SOP-QC-509-012

509离子交换液相色谱法电荷异质体分布检测标准操作规程SOP-QC-509-010

509亲水作用液相色谱法寡糖分布检测标准操作规程SOP-QC-509-013

509毛细管电泳IgG纯度异质体分析标准操作规程SOP-QC-509-011

体积排阻液相色谱法标准操作规程SOP-QC-OPE-005

CHO宿主细胞蛋白残留量测定标准操作规程SOP-QC-OPE-018RT-

PCR法CHODNA残留量测定标准操作规程SOP-QC-OPE-061蛋白A

残留量测定标准操作规程SOP-QC-OPE-019

509生物活性测定标准操作规程SOP-GE-509-001

509结合活性测定标准操作规程SOP-GE-509-002

UV法蛋白含量测定标准操作规程SOP-QC-OPE-OOlUV-VIS

法聚山梨醋80含量测定标准操作规程SOP-QC-OPE-028

27

资料13SYB509注射液

第二部分制造和检定规程起草说明

依据《中华人民共和国药典》和国家药品监督管理局的《药品注册管理办法》、

《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》、《人用单克隆抗体质量控制技术指导

原则》，以及本申报产品的具体特性，我司起草了《SYB509注射液制造及检定规程

草案》。现对个别特殊性的条款说明如下。

1.蛋白含量

SYB509注射液项目拟采用的消光系数是通过紫外法分别测定同类产品和

SYB509注射液样品的消光系数，确定了A280nm的消光系数为1.68L/g*cm］（部分软

件中采用1%蛋白浓度的消光系数为16.8）,并用紫外法对ProteinA亲和层析之后工

艺过程的中间产品、原液、半成品、成品进行蛋白含量测定。

原研产品分装批号A180值£计算值£均值RSD(%)

16.8051.6805

OPDIVO2015110116.80316.8031.680.02

16.79916.799

1.1凯氏定氮蛋白浓度测定

采用5.99的蛋白氮换算系数委托国际权威第二方检测机构SGS进行蛋白浓度测

定，采用凯氏定氮法测定值为13.9g/Lo

28

SYB509注射液资料13

1.2同类产品消光系数测定

使用超纯水作为样品空白对照液，直接点样测定二批OPDIVO产品的A28O吸收

值，同时按照标示浓度10g/L计算消光系数£。

表2二批同类产品消光系数测定

分装批号A180值£计算值。均值RSD(%)£总均值总RSD(%)

17.3571.7357

2017070117.4721.74721.73940.39

17.3531.7353

18.7291.8729

2017070218.9311.89311.88290.541.774.86

18.8281.8828

17.0311.7031

2017070316.9131.69131.69280.57

16.8401.6840

如上表所示，二批同类产品的测量偏差RSD均小于2%,控制较好，检测获得

的OPDIVO消光系数为1.77,SYB509注射液项目拟采用的同类产品消光系数为1.68,

相比为105.4%,两者基本一致。

1.3SYB509注射液样品消光系数测定

509-FFT-DS20170619批样品:用200mmol/LpH值6.8~7.2的磷酸盐缓冲液PB)

稀释36倍后采用紫外吸收法测定A283A340值，同时使用凯氏定氮法测定的蛋白含量

13.9g/L计算消光系数以

表3SYB509注射液样品消光系数测定

批号A280-A340值£计算值£均值RSD(%)

0.63051.6329

201706190.63071.63351.630.05

0.63011.6319

如上表所示，数据测量偏差RSD小于2%,控制较好，检测获得的消光系数为

1.63,SYB509注射液项目拟采用的同类产品消光系数为1.68,相比为97.0%,两者

29

资料13SYB509注射液

一致。

2.SYB509注射液抗体溶液(制剂缓冲液)密度的标定

SYB509注射液采用中棚硅玻璃管制注射剂瓶包装，单瓶装量为10ml/瓶，在其

配制，灌装及待包装品、成品装量检查时采用称重法，因此对SYB509注射液抗体

溶液(含制剂缓冲液)的密度进行了标定，建立密度曲线，为原液质量与体积的换算

以及制剂的配制和灌装提供数据支持。

首先使用制剂缓冲液将原