番茄病毒鉴定技术规程

1番茄病毒鉴定技术规程本文件规定了番茄病毒鉴定中的术语与定义、检测对象、抽样、取样部位、鉴定方法和判定规则等本文件适用于内蒙古侵染番茄的病毒种类的鉴定。2规范性引用文件本文件没有规范性引用文件。3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1番茄Solanumlycopersicum茄科茄属一年生或多年生草本植物，原产于南美洲，如今在世界各地广泛栽培。3.2逆转录-聚合酶链式反应Reversetranscription-polymerasechainreaction（RT-PCR）聚合酶链式反应Polymerasechainreaction（PCR）提取番茄样品的总RNA（总DNA对于RNA病毒，以其中的mRNA为模板，利用逆转录酶反转录合成cDNA，再以cDNA为模板使用侵染番茄的病毒特异性引物进行聚合酶链式反应；对于DNA，以总DNA稀释液（按浓度比例稀释）为模板使用侵染番茄的病毒特异性引物进行聚合酶链式反应。4检测对象主要鉴定病毒种类：1)苜蓿花叶病毒（Alfalfamosaicvirus，AMV）2)蚕豆萎蔫病毒2（Beanbroadwiltvirus2，BBWV2）3)辣椒脉斑驳病毒（Chilliveinalmottlevirus，ChiVMV）4)黄瓜花叶病毒（Cucumbermosaicvirus，CMV）5)凤果花叶病毒（Pepinomosaicvirus，PepMV）6)车前草花叶病毒（Plantagoasiaticamosaicvirus，PlAMV）7)辣椒轻斑驳病毒（Peppermildmottlevirus，PMMoV）8)马铃薯S病毒（PotatoVirusS，PVS）9)马铃薯X病毒（PotatoVirusX，PVX）210)菠菜潜隐病毒（Spinachlatentvirus，SpLV）11)南方番茄病毒（Southerntomatovirus，STV）12)番茄不孕病毒（Tomatoaspermyvirus，TAV）13)番茄黑环病毒（Tomatoblackringvirus，TBRV）14)烟草蚀纹病毒（Tobaccoetchvirus，TEV）15)烟草轻型绿花叶病毒（Tobaccomildgreenmosaicvirus，TMGMV）16)烟草花叶病毒（Tobaccomosaicvirus，TMV）17)番茄褐色皱纹果病毒（Tomatobrownrugosefruitvirus，ToBRFV）18)番茄丛矮病毒（Tomatobushystuntvirus，ToBSV）19)番茄褪绿病毒（Tomatochlorosisvirus，ToCV）20)番茄斑驳花叶病毒（Tomatomottlemosaicvirus，ToMMV）21)番茄花叶病毒（Tomatomosaicvirus，ToMV）22)番茄斑萎病毒（Tomatospottedwiltvirus，TSWV）23)芜菁黄化病毒（Turnipyellowsvirus，TuYV）24)烟草脉带花叶病毒（Tobaccoveinbandingmosaicvirus，TVBMV）25)番茄环纹斑点病毒（Tomatozonatespotvirus，TZSV）26)番茄黄化曲叶病毒（Tomatoyellowleafcurlvirus，TYLCV）27)中国番木瓜曲叶病毒（PapayaleafcurlChinavirus，PaLCuCNV）确定依据：参考国内外番茄病毒研究相关论文确定。5抽样采用5点取样法随机抽取。1000株以内抽检10株(含1000株)；1000株～10000株(含10000株),10000株按上述方法抽样，之后每增加1000株增检20株，不足1000株按1000株计。6取样部位疑似病毒病感染的番茄植株，症状如花叶、皱缩、畸形、黄化、坏死等。取番茄植株茎秆和叶柄放置于自封袋内，4℃保存不超过24h或液氮预冷后立即放置于-80℃长期保存备用，其成熟果实保留种子备用。7鉴定方法7.1逆转录聚合酶链式反应法（RT-PCR法）、聚合酶链式反应法（PCR法）7.1.1试剂盒RNA提取试剂盒(DNA提取试剂盒)：选择适合提取含有多糖多酚材料的RNA（DNA）试剂盒。反转录试剂盒：使用市售的商品反转录试剂盒，按照说明进行操作。PCR扩增试剂盒：使用市售的商品PCR扩增试剂盒，按照说明进行操作。7.1.2引物侵染番茄的病毒特异性检测引物（如表1）。表1已报道的侵染番茄的病毒特异性检测引物病毒引物名称引物序列（5’→3’）目标片段（bp）VirusPrimernamePrimersequenceTargetfragmentAMVdFAMVAMVdRBBWV2dFBBWV2BBWV2dRChiVMVdFChiVMVChiVMVdRCMVPep3PepMVPep4PlAMV-cpupPLAMVPlAMV-cpdwPMMoVdFPMMoVPMMoVdRS3FPVSS4RPVXdFPVXPVXdRSpLVdFSpLVSpLVdRSTVdFSTVSTVdRTAVTBRV-FTBRVTBRV-RTEV-FTEVTEV-RTMGMVdFTMGMVTMGMVdRGTGCGTATAGATGCCGGTTC900GAGCGAATAGGACTTCATACCAGRTATATGCTTGGGCAAGCGCATG490CATGAACATTCCCCATCTCCACGTGGGAAARGCNCCNTAYAT790CGCGCTAATGACATATCGGTGTTTATTTACAAGAGCGTACGG632GGTTCGAARRWATAACCGGGATGAGGTTGTCTGGTGAA624AATTCCGTGCACAACTATCCGCGGCCGCCACACTACTC932GGCCCACCAGACTTTCACTCCTCTTCCGAGAGAATCTGAGAC703CGTGTTTCCAAACTTCAGCCAAGTTTGAGATAGGTAGGCCCTCGAGGGGTCATACTGAAAGTTGTAGTGCGCGAGGTTTACCAATC790GTGGTTTGCCGCGAACGATTCGCACTCTCCTCAGCCTTTG1077TCTGACGAGCATCATATAGTTTCCTGATGGAGGATATCTACTGTCATT582ACAAGATGTTTAAAGCCGTGTCCATGGCCCAAAACGGTACGG657TCACACCGGGAGCGTTGAAGCGCTAGAAGTGAGCCTATG730TCAGCTAGGAGTTTCGCAGTGATGGATGGTGAGGAG347GTGCCGTTCAGTGTCTTGAGGAAATTGAGGATAATGTAAGTG700ACGCCATACCACAGTATACAC4TMVToBRFVToBSVToCVToMMVToMVTSWVTuYVTVBMVTZSVTYLCVTYLCVPaLCuCNVTMVdFTMVdRToBRFV-FToBRFV-RToBSVFToBSVR1ToCVdFToCVdRToMMVdFToMMVdRToMVdFToMVdRTSWVdFTSWVdRTuYV-F2TuYV-R2PIPO-FPIPO-RTZSVdFTZSVdRTYLCV-1TYLCV-2TYLCV-FTYLCV-RSC249FGATTCGTTTTAAATATGTCTTAC600CTTCGATTTAAGTGGAGGGACTTCCAAACGTGTACGCAC604GTCGAGAGATATGTCGAATAGATCCATACCAATCATACCGCTGTT78TAGTTCATTGCCAAAAGCCTTGAGCTTCCGAAACTCCGTCTTG439TGTCGAAAGTACCGCCACCCTGGAGAAGACTGGGTCTAGTTCGGTAAGTTCAATGGGACCTTCTCAAGAATGTTACACGGGAAG980CGCATTCTCCGTAATTTTGATCTCACTGTAATGTTCCATAGCAA861AGAGCAATYGTGTCAATTTTATTCGCCGCYTGTTTCTCAGTTCTGRACTAACCACGAGTAAAGAAGCTCAATACCATGGAATCTATCAACAGGATTTGG235GAACTAGTAAGTTGTCCTGTGCATATTGTGGTTAAAAAGACAGATCATTGCT852CTACTTGCCAACATGTCTAACGTCTAATCATTTCCACGCCCGTCTCG648GGTTCTCATACTTGGCTGCCTCCTCGGGATCCACTTCTAAATG2800CGGGATCCCACATATTGCAAGACTCCCCAGATACATTAGGGTACG2800SC249RTGTTTGACGTGACTACTTGGGGAC7.1.3操作方法7.1.3.1总RNA（总DNA）提取7.1.3.1.1提取方法5按照RNA提取试剂盒（DNA提取试剂盒）操作说明书步骤提取。7.1.3.1.2判定规则提取的RNA（DNA）质量判定参照DB6111/T172—2021执行。DNA判定采用电泳法检测，RNA有两条条带，条带清晰明亮，微量分光光度计测得OD260/OD280比值1.8至2.2，以此为模板进行后续试验或置于-80℃条件下封口保存。不符合以上指标的需重新提取。7.1.3.2逆转录按照反转录试剂盒操作说明书步骤进行逆转录。7.1.3.3病毒检测7.1.3.3.1PCR扩增7.1.3.3.1.1PCR反应体系在PCR反应管中依次加入10µL2×M5Hiper超光速mix、上下游引物各1.0µL、模板2.0µL、无酶水6.0µL，PCR反应体系为20µL。病毒特异性检测上下游引物见表1。7.1.3.3.1.2PCR反应程序按PCR扩增试剂盒操作说明书步骤进行聚合酶链式反应，待测病毒特异性检测引物退火温度按指定值进行输入，延伸时长可根据片段大小适当调整，采用琼脂糖凝胶电泳法检测PCR产物。7.1.3.4电泳检测制备1%的琼脂糖凝胶，每个泳道加入5.0µL