试论牛卵母细胞体外受精技术

牛卵母细胞体外受精是指在脱离母体的情况下，人为创造母牛体内繁殖条件，在牛体外完成精卵结合，培育出受精卵并在体外培养至桑椹胚或是囊胚阶段，将胚胎移植到母牛体内孕育胎儿。体外受精是繁育犊牛的重要技术，在牛繁殖领域应用普遍，涉及到的技术有牛卵母细胞的采集、成熟培养与判断，牛精子的筛选、获能，以及具体的受精操作等。针对技术应用关键节点及技术参数、操作细节的分析研究，最终达到获取高质量胚胎的目的，助力于养牛业的高质量发展。1牛卵母细胞体外采集与培养技术1.1牛卵母细胞体外采集技术1.1.1采集方式常用的动物卵母细胞采集方式如下：（1）直接采集成熟的卵母细胞，采用超排技术从动物的输卵管采集，但不适用于牛这种大型动物；（2）活体采卵，选择繁殖性能优秀的母牛，借助腹腔镜直接采集，对采集母牛的繁殖性能影响较小；（3）从屠宰场获取，宰杀母牛后直接采集牛卵巢。该采集方式简单、直接、成本低，可大批量采集。1.1.2采集技术在从屠宰场获取牛卵巢后，将其放入保温瓶中，瓶中事先装入用生理盐水稀释的硫酸庆大霉素，温度大约是30℃，用于保持牛卵巢的新鲜度。在1h内完成卵泡的收集，在实验室环境下，使用生理盐水清洗干净牛卵巢，然后使用注射器直接吸取卵泡，获取卵泡液，准备进行体外成熟培养。1.2体外成熟培养使用体视显微镜筛选质量好的卵母细胞用于体外成熟培养，将筛选出的卵母细胞放入培养液中，培养液中含有17-E2的中央记忆型T细胞1.5μg/mL；胎牛血清10%，促黄体生成素20%；卵泡刺激素20μg/mL。将培养液放入经过温度校正后的培养箱中，温度调整至38～39℃，气象条件为5%的CO2，培养时间22～24h，需根据牛卵母细胞采集时的成熟情况，适当延长1～2h，但不可超过26h，一旦超过牛卵母细胞将进入老化期。1.3体外成熟判定在培养24h后进行牛卵母细胞的成熟检查，当其进入第二次减数分裂中期则判定为成熟。由于牛卵母细胞成熟需经历第一次与第二次减数分裂期，整个成熟过程复杂，成熟判定难度较大。因此一般情况下以生发泡破裂或是卵丘细胞扩展为判断标准，以显微镜检查卵丘细胞扩展为例，1级成熟卵，卵丘细胞扩展程度超过裸卵直径的3倍，2级则是2倍，3级为轻度扩展，大于3级的情况下则可判定牛卵细胞成熟，具备进行体外受精的条件。2牛精子体外获能技术牛精子体外获能是提高受精率的重要方式，只有其在母牛的生殖道内停留一段时间，在适宜的温度、pH值、渗透压等条件下，牛精子发生一系列的变化后获取受精能力。如果直接将精子与牛卵母细胞结合，牛精子在未获能的情况下，受精率非常低。所以在牛卵母细胞体外受精过程中，精子体外获能技术的应用是其中的关键环节，在体外环境下诱导牛精子获能，进一步的培养其受精能力。2.1影响获能因素精子体外获能技术是创造与精子体内获能相似的条件，促进牛精子正常的生理与生行反应。通过牛精子体内获能过程的分析，确定了如下影响牛精子获能因素：（1）精子来源，牛精子获能时间大约为1h，牛采精部位的不同会直接影响到牛精子获能，在精子体外获能操作过程中，需重点关注该影响因素。（2）温度，牛精子所处获能环境细微的温差变化对精子获能有着一定的影响，经过大量的实践发现，牛精子体外获能最佳温度是38.5～39℃，大部分哺乳动物是37～38℃。（3）pH值，最佳pH7.4～8.0，偏高会减少体外获能时间，过高则会杀死精子，偏低则增加获能时间。（4）渗透压，渗透压在295～315mOsm/L的条件下，牛精子体外获能效果最好。（5）钙离子载体，其对牛精子顶体反应有着积极作用，有助于糖酵解，为精子运动提供充足的能量。钙离子载体与钙离子形成复合物，进入精子促进其顶体反应。但如果钙离子载体浓度过高，作用过于强烈，作用时间过长会引起精子死亡。（6）氨基多糖，氨基多糖有利于钙吸收，促进牛精子发生顶体反应。但氨基多糖的类型不同，影响着牛精子的获能水平。比如在牛精子液体中添加肝素10～50μg/mL，处理10～50min，诱导牛精子体外获能效果良好。（7）高离子强度液，使用渗透压为380mOsm/L的高离子强度液氯化钠处理牛精子，置换精子表面的抗原物质，刺激牛精子的顶体反应。（8）咖啡因，具有抑制环腺苷酸二酯酶的作用，提升精子活力，与钙离子载体、肝素等联合运用，可增加牛精子获能的水平。（9）血清白蛋白，其为大分子物质，在处理牛精子过程中，与精子膜中的胆固醇结合，减少了精子脂肪，释放精子活力，提高牛精子的受精率。2.2精子筛选方法未经处理的牛精液中含有一些有害物质，采用精子预处理方法去除其中的精清、死精子、弱精子等，筛选出适合体外受精的精子，以改善精子获能。比较常用的处理方法有精子上浮法、Percoll密度梯度分离法、离心洗涤法等。精子上浮法预处理较为简单，解冻精子后放入TALP培养液中，静置大约1h，提取上浮的精子。Percoll密度梯度分离法，借助Percoll大分子硅胶颗粒离心处理，平衡分离精子，使不同密度的精子分布在不同密度的梯度中。离心洗涤法适用于冷冻精液，主要是去除冷冻保护剂与精浆蛋白，但在洗涤过程中容易损伤精子。2.3获能操作方法牛精子体外获能选用BO液，在其中添加25μg/mL肝素钠，6μg/mL牛血清白蛋白，培养液pH值调整至7.6。采用精子上浮法筛选出优质精子70μL，制作成精子悬浮液。在培养皿上制作3个100μL的受精液微滴，每个微滴上滴入3μL的精子悬浮液，然后放入CO2浓度为5%，38℃的培养箱中，牛精子持续获能60min。2.4检测精子质量在牛精子获能操作过程中，使用显微镜检测牛精子获能情况。一方面是精子获能时检测，在显微镜下可观察到精子非常活跃，尾部活动明显；另一方面是精子获能后检测，精子在获能后，头部曲线运动，尾部鞭打有力，幅度加大，表现为超激活运动。3牛卵母细胞体外受精技术3.1体外受精原理体外受精是成熟牛卵母细胞与获能牛精子的结合过程，促使牛精子顺利进入牛卵母细胞，最终形成胚胎。受精的基本原理是人为创造牛体内受精条件，经过对精子的离心洗涤、上浮处理后，获取高质量精子，获能后与成熟卵母细胞共同放入受精液中，促进精卵相遇，完成原核发育。3.2精卵比例把控牛卵母细胞体外受精采用微滴（包含10～15个卵母细胞），微滴大小在50～200μL，精子浓度为0.64～1.0×106个/mL。在牛正常体内受精的情况下，精卵的比例一般是1～15:1，在体外授精的情况下，通过精卵比例的换算，确定精卵比例在10000～20000:1，所以采用了上述的卵母细胞个数与精子浓度。如果精子浓度过低，直接降低受精率，过高则会提升多精受精的概率，降低囊胚发育的质量。3.3精卵作用时间控制体外受精选用的受精液不同，精卵作用的时间会有较大的差异，比如在BO液中大约是7h左右，在TALP液中大约是19h，少于16h会降低受精的质量。在体外受精研究中，有的人使用TALP作为受精液，精卵作用5h后，提取出卵母细胞，然后放入早期培养液中，以此避免水解酶对受精卵的损伤，并且精卵共同孵育时间过长，会增加多精子受精量。所以在使用TALP受精液时，孵育时间不可少于18h，但不可超过24h。3.4体外受精操作方法首先取出培养成熟的牛卵母细胞，放入受精液中洗涤4次；其次平衡处理获能牛精子，制作成悬浮液微滴，精子浓度为0.8×106个/mL，接着在每个微滴上添加100μL卵母细胞液，保证每个精子微滴上有10～15个卵母细胞；再次，将放有精卵微滴的培养皿放入培养箱中，培养箱中CO2浓度为5%，湿度为100%，温度为38℃，如果是BO受精液培养时间6～8h，TALP受精液培养时间20～24h。培养过程中使用显微镜观察受精卵的卵裂情况。在体外授精中需注意把握好精卵相遇的时间，最好是精子发生顶体反应时与卵子相遇，以确保精子顺利进入牛卵母细胞。牛卵母细胞体外受精还可直接采用显微镜进行操作，在显微镜下将精子注入牛卵母细胞中，直接完成受精，在精子数量有限的情况下适合采用该方法。3.5受精检测与判断卵裂是判断牛卵母细胞体外受精是否成功的依据，牛卵母细胞在没有受精的情况下，卵母细胞的周隙很小，在受精后周隙增加，但有的老化卵也会出现该现象，需要继续培养，观察囊胚的发育情况。牛卵母细胞体外受精受到人为操作、培养环境与条件的影响，出现异常受精现象，常见的有多精受精、胚胎染色体异常等，应在受精阶段做好受精检测与判断，及时发现受精异常问题，以提高受精成功的概率。3.6体外受精注意事项3.6.1注意解决多精受精问题在牛卵母细胞成熟判定中，主要的依据是原核发育情况，但原核成熟不是牛卵母细胞成熟判定的唯一标准，还需判断细胞质、透明带等的成熟情况，以此方可保证精卵之间的正常作用和变化，形成对多精的防御，避免多个精子在牛卵母细胞中生理变化。在体外受精过程中，可适当增加牛卵母细胞的培养时间，确保完全成熟，或严格控制受精时精子的密度，以及进行受精液中影响精子活力物质的调整，以降低多精受精的发生概率。3.6.2避免胚胎发育阻滞的发生胚胎发育阻滞是体外受精面临的难点，一般好发生在胚胎发育早期，主要的原因是胚型基因激活滞后，导致胚型基因激活失败。为了避免发育阻滞的出现，在完成牛卵母细胞受精后，利用中间受体（兔或绵羊的输卵管）培养受精卵至囊胚阶段，然后再进行移植操作，也可采用“TCM199+血清”与体细胞（输卵