3.1重组DNA技术的基本工具课件高二下学期生物人教版选择性必修3

看到这张图片你能想到什么可以改善我们生活的愿望吗？树：不能发光萤火虫：能发光愿望发光树如果能得到这种到了晚上自己能发光的树该多好啊！第3章基因工程按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。操作对象及环境操作水平操作原理结果环境：生物体外对象：基因DNA分子水平赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因重组①【概念剖析】优点？能克服远缘杂交不亲和的障碍；定向改造生物的遗传特性。②基因工程理论基础的分析【问题探究1】为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？（1）DNA的基本组成单位都是

。（2）DNA分子都遵循

配对原则。（3）双链DNA分子的空间结构都是

。【问题探究2】为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？（1）

是控制生物性状的独立遗传单位。（2）遗传信息的传递和表达都遵循

。（3）生物界共用一套

。四种脱氧核苷酸规则的双螺旋结构基因中心法则遗传密码碱基互补【从社会中来】番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当番木瓜被这种病毒侵染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。DNA双螺旋的直径只有2nm，对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？这些“分子工具”各具有什么特征呢？转基因“华农1号”番木瓜非转基因番木瓜第1节

重组DNA技术的基本工具“分子手术刀”准确切割DNA分子“分子缝合针”“分子运输车”将DNA片段连接起来将体外重组好的DNA分子导入受体细胞限制性内切核酸酶——“分子手术刀”阅读教材P71，回答下列问题：

3min1.限制酶的来源？2.限制酶的特点？3.限制酶的作用部位？4.限制酶的识别序列长度？5.限制酶的切割结果？自学指导一简称限制酶限制酶是用生物属名的头一个字母与种加词的头两个字母，组成了3个字母的略语，以此来表示这个酶是从哪种生物中分离出来的。限制酶的命名是根据细菌种类而定，以EcoRI为例：

E：Escherichia

（属名）

co：coli

（种加词）

R：RY13（品系）

I：分离出的第一种限制酶资料卡

限制酶名字的由来EcoRⅠ属名Escherichia首字母种名coli前两个字母R型菌株从中分离的第一种限制酶EcoRⅠ：大肠杆菌（Escherichiacoli）R型菌株中分离出的第一种限制酶。SmaⅠ：粘质沙雷氏菌（Serratiamarcescens）中分离出的第一种限制酶。流感嗜血杆菌的d菌株（Haemophilusinfluenzaed）中先后分离到3种限制酶，则分别命名为：

。HindⅠ、HindⅡ、HindⅢ资料卡

限制酶名字的由来一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”3.特点：4.作用部位:能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。特定部位的磷酸二酯键还记得磷酸二酯键在哪吗

1.来源：主要从原核生物中分离纯化出来的

2.种类：数千种（限制酶不是一种酶，而是一类酶）TACGGCATGCGCAT5´3´5´3´相邻两个核苷酸之间的键：磷酸二酯键CH2

HOHHHHH碱基

磷酸

5’4’3’2’1’脱氧核苷酸一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”5.识别序列长度？大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成；EcoRⅠSmaⅠTaqⅠ5’…T-C-G-A…3’3’…A-G-C-T…5’也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。特点1：都可以找到一条中心轴线；特点2：中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的，称为回文序列。（1）实例1——EcoRⅠ限制酶切割

*EcoRⅠ识别序列为GAATTC*EcoRⅠ切割部位为GA之间的磷酸二酯键黏性末端黏性末端（2）实例2——SmaⅠ限制酶切割*SmaⅠ识别序列为CCCGGG*SmaⅠ切割部位为CG之间的磷酸二酯键平末端6.切割结果:1.限制酶是一类酶而不是一种酶。2.限制酶作用于磷酸二酯键，而不是氢键。3.不同种类的限制酶识别的序列与切割的位点不同，这与酶的专一性是一致的。4.限制酶的识别序列与被作用的DNA序列是不同的。前者一般由6个核苷酸组成，少数由4个、8个或其他数量的核苷酸组成；后者是双链核苷酸序列。5.限制性内切核酸酶可用于切割DNA以获取目的基因，也可用于切割载体。6.两个末端若是由同一种限制酶切割产生的，则两片段连接后还具有该种限制酶的识别序列和切割位点。【练习1】：写出下列限制酶切割形成的黏性末端BamHⅠ________EcoRⅠ________HindⅢ________BglⅡ________

GATCAATTAGCTGATC思考：同种限制酶切割的黏性末端一定相同吗？不同种限制酶切出的黏性末端一定不同吗？不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端【练习2】：教材P74课后题拓展应用2有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeⅠ进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ、XbaⅠ、EcoRⅤ和XhoⅠ进行切割，各限制酶的识别序列和切割位点如下：哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶SpeⅠ切割的A片段产生的DNA片段相连接，为什么？XbaⅠ因为XbaⅠ与SpeⅠ切割产生了相同的黏性末端（可互补）【练习3】请判断：以下黏性末端是由

种限制酶作用产生的。3①②③【练习4】图甲是一个DNA片段，箭头处代表不同限制酶的切点，据图回答：（1）用EcoRⅠ酶切，能得到

种DNA片段；（2）用PstⅠ完全酶切，能得到

种DNA片段；（3）同时用SmaⅠ和PstⅠ完全酶切，能得到

种DNA片段；（4）只用PstⅠ酶切，最多能得到

种DNA片段。2355【思考1】限制酶存在于原核生物中的作用是什么？原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA，起防御作用。原核细胞DNA中不存在限制酶的识别序列或能被识别的序列被修饰了。【思考2】为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？DNA连接酶——“分子缝合针”阅读教材P72，回答下列问题：

4min1.DNA连接酶的作用？2.DNA连接酶的种类？3.对比分析DNA连接酶、DNA聚合酶及其他与DNA相关的酶？4.基因工程中使用的载体有哪些？5.质粒的特点？6.载体需要具备哪些条件？自学指导二基因导入受体细胞的载体——“分子运输车”①E·coliDNA连接酶②T4

DNA连接酶将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。二、DNA连接酶——“分子缝合针”

1、作用：

2、种类：（只能连接黏性末端）（既可连接黏性末端，又可连接平末端）思考：DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？大肠杆菌T4噬菌体归纳：比较DNA连接酶和DNA聚合酶种类DNA聚合酶DNA连接酶不同点作用实质催化

与已有脱氧核苷酸链片段连接，形成

.

催化两个

之间形成

.

作用结果催化形成与模板链互补的DNA链，形成新的双链DNA分子催化具有

黏性末端或平末端的

连接起来，形成

.

模板

.

.

相同点①化学本质都是蛋白质；②都是催化形成

.单个脱氧核苷酸磷酸二酯键两个DNA片段磷酸二酯键磷酸二酯键需要不需要互补DNA片段重组DNA分子【核心归纳】与DNA相关的几种酶的比较项目DNA连接酶限制酶DNA聚合酶解旋酶DNA酶作用部位磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键氢键磷酸二酯键作用对象DNA片段DNA单个脱氧核苷酸DNADNA作用结果将两个DNA片段连接成完整的DNA分子切割双链DNA分子将单个脱氧核苷酸连接到DNA单链末端将双链DNA分子局部解旋为单链将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸载体种类：质粒、噬菌体、动植物病毒等三、基因导入受体细胞的载体——“分子运输车”质粒：一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，具有自我复制能力的环状双链DNA分子。【注意】真正被用作载体的质粒，都是经过过人工改造的。携带目的基因导入受体细胞中，使之在受体细胞内稳定存在并表达。最常用的载体——质粒终止子:

转录的终点，在转录过程中起调控作用。启动子:

RNA聚合酶识别、结合和开始转录的序列复制原点:

DNA复制的起始位点标记基因:便于重组DNA的筛选与鉴定其基因属于细胞质基因【分析归纳载体需要具备的条件】问题1：载体要与外源基因连接，需要具备什么条件？问题2：要使携带的外源基因在受体细胞中稳定存在，载体需要具备什么条件？问题3：我们用肉眼看不到载体是否进入受体细胞，为了便于筛选重组DNA分子，载体需要具备什么条件？条件①：具有一个或多个限制酶切割位点；条件②：能在受体细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制；条件③：具有标记基因，便于重组DNA分子的筛选。条件④：载体DNA必须是安全的，不会对受体细胞有害。【核心探讨】标记基因的筛选原理载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。限制酶的选择1.酶切位点要保证目的基因是完整的2.酶切位点要要位于启动子和终止子之间（启动子下游）限制酶DNA连接酶载体①对受体细胞无害；②有一个至多个限制酶切割位点；③有特殊的标记基因；④能自我复制或能整合到宿主DNA上。质粒、噬菌体、动植物病毒小结基因工程的基本工具作为载体的条件种类:磷酸二酯键来源：主要来源于原核生物特点：作用部位：具有专一性结果：形成黏性末端或平末端连接部位：磷酸二酯键种类：E.coliDNA连接酶、T4DNA连接酶作用：把两条双链DNA片段拼接起来

1.DNA

酒精，某些蛋白质

酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋白质。2.DNA在不同浓度的

中的溶解度不同，它能溶于

的NaCl溶液。DNA的粗提取与鉴定探究.实践一、实验原理3.在

下，DNA遇

试剂会呈现

。不溶于溶于NaCl溶液2mol/L二苯胺蓝色一定温度二、实验材料新鲜洋葱、香蕉、菠菜、猪肝、鸡血等原则上，凡是含有DNA的生物材料都可以考虑;DNA含量越高，成功的可能性越大。三、实验试剂研磨液、体积分数为95%的酒精、2mol/L的NaCl溶液、二苯胺试剂、蒸馏水1.称取约30g洋葱，切碎后放入研钵中，倒入10mL

，充分研磨。2.（方案一）在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液

到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取

。（方案二）将研磨液倒入塑料离心管中，在1500r/min的转速下

5min，再取

放入烧杯中。溶解并提取DNA研磨液过滤上清液离心上清液四、实验步骤上清液中可能还含有核蛋白、多糖等杂质为减少DNA的损失，过滤过程一般使用纱布低温放置几分钟的作用：①可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；②抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出；③低温有利于增加DNA的柔韧性，减少其断裂。3.（方案一）在上清液中加入体积相等的、预冷的

（体积分数为95%），静置2～3min，溶液中出现的

就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分。（方案二）将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下

5min，弃上清液，将

（粗提取的DNA）晾干。析出DNA，使DNA与杂质分开酒精溶液白色丝状物离心管底的沉淀物减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子4.取两支20mL的试管，各加入5mL

。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCl溶液中。然后，向两支试管中各加入4mL的

。混合均匀后，将试管置于

中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。2mol/L的NaCl溶液二苯胺试剂沸水（现配现用，用棕色瓶保存）（溶解DNA，并去除部分杂质蛋白）溶液蓝色的深浅与溶液中DNA的含量的多少有关对照组实验组实验结果不明显的可能原因：①材料中的核物质没有充分释放出来，研磨不充分或蒸馏水的量不够；②加入酒精后摇动或搅拌时过猛，DNA被破坏；③二苯胺最好现用现配，否则二苯胺变成浅蓝色，影响鉴定效果。以血液为实验材料时，每100mL血液中需要加入3g柠檬酸钠，防止血液凝固。利用动物细胞提取DNA破碎细胞的方法：动物细胞无细胞壁，可直接吸水涨破。五、结果分析与评价思考：1.如果选用鸡血细胞进行实验，如何快速破碎细胞？2.有时会在DNA滤液中添加嫩肉粉（木瓜蛋白酶），这样有什么好处？3.有时还会反复利用不同浓度的NaCl溶液来溶解、析出DNA，试猜想该操作的目的？将鸡血细胞置于蒸馏水中，待细胞涨破后，收集滤液利用蛋白酶分解杂质蛋白，不分解DNA，有利于DNA与蛋白质分开进一步纯化DNA。用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐溶液中不能溶解的杂质；用低盐溶液使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。刑侦破案拓展：DNA提取的应用基因组测序插入人胰岛素基因的大肠杆菌基因工程亲子鉴定练习与应用一、概念检测1.DNA连接酶是重组DNA技术