抗肿瘤药物体内筛选试验标准操作规程(SOP)模板

抗肿瘤药物体内筛选试验标准操作

规程(SOP)

抗肿瘤药物体内筛选标准操作规程

概述:

抗肿瘤药物是指能够直接杀伤或抑制肿瘤

细胞生长或增殖的一类药物，作用机制包括抑制

肿瘤细胞核酸或蛋白质的合成、干扰大分子物质

代谢、干扰微管系统、抑制拓扑异构酶等。

本操作规程包括与抗肿瘤药物申请临床试

验和申请上市有关的非临床有效性和安全性研

究的内容，其中着力强调非临床有效性和安全性

之间的关联性，以及非临床研究和临床试验之间

的关联性。旨在一方面为抗肿瘤药物的非临床研

究提供技术参考；另一方面，通过技术要求引导

科学有序的研发过程，使国内此类药物的研发更

趋规范和合理。

本操作规程仅代表当前对抗肿瘤药物非临

床研究的一般性认识。具体药物的非临床研究应

在本指导原则的基础上，根据药物的自身特点制

订研究方案。

研究目的：

建立一套包括抗肿瘤药物体内作用的药效

学研究和评价体系及相应的标准操作规程以及

抗肿瘤药物安全性和作用新机制的研究。

①有效性研究

抗肿瘤药物有效性研究的目的主要在于探

索受试物的作用机制、作用强度、抗瘤谱等，为

之后的安全性评价以及临床试验中适应症、给药

方案的选择提参考信息。

②安全性评价

安全性评价的目的主要包括：（1）估算I期

临床试验的起始剂量；（2）预测药物的毒性靶

器官或靶组织；（3）预测药物毒性的性质、程

度和可逆性；（4）为临床试验方案的制订提供

参考。

研究计划：

（a）小鼠急性毒性测试

按照急性毒性测试的常规方法，选用昆

明种小鼠，通过腹腔注射方式给药，测定体外抗

肿瘤活性突出的化合物的半数致死量（LDG,

参考给药小鼠体重变化情况，评价化合物的急性

毒性，并确定小鼠体内抗肿瘤活性测试的给药剂

量。

（b）小鼠体内抗肿瘤活性测试

根据动物体内抗肿瘤活性测试的标准方法，选用昆明种小鼠，皮下接种

肉瘤S180或肺癌H22瘤株，选择体外活性突出且急性毒性较低的化合物，设定

合适的剂量通过腹腔注射方式给药，以临床常用抗肿瘤药物环磷酰胺作为阳性对

照药物，测定肿瘤生长抑制作为体内活性评价指标。

(C)专利保护范围内的化合物的继续合成

申请保护范围较大的专利，合成部分可能

具有良好活性的新的化合物，拓展研究范围，发

现活性更强的化合物，并申请新的发明专利。并

可针对具体化合物申请从属专利，延长高活性化

合物的保护期限。

(d)体外抗肿瘤活性的广泛筛选

采用MTT法或台盼蓝染色法，测定化合

物对多种人肿瘤细胞株的增殖抑制活性，确定化

合物在不同瘤株间抗肿瘤活性的选择性，为裸鼠

模型实验提供依据。

(e)抗肿瘤作用机理的深入研究

根据抗肿瘤(f)人癌裸鼠移植瘤模型实

验活性化合物作用机理特征，选用微管蛋白聚合

等实验从分子水平确认化合物的作用机理；利用

人脐静脉血管内皮细胞探讨化合物对内皮细胞

骨架的影响及诱导凋亡的途经，从细胞水平上阐

明化合物的作用机理。

根据抗肿瘤新药审批办法的要求，采用

裸小鼠皮下接种模型和/或原位移植瘤模型，以

相对肿瘤增值率和生存时间为指标，确定化合物

的抗肿瘤活性。

(g)动物体内药物代谢动力学实验

选择在人癌裸鼠移植瘤模型实验中活性

良好的化合物，开展动物体内药物代谢动力学实

验，考查化合物的吸收、分布、代谢、排泄性质。

(h)动物亚急性，长毒实验

根据抗肿瘤新药审批办法的要求，测定

动物亚急性、长毒性质，进行药物安全性评价。

基本方法：

①小白鼠的灌胃法

以左手捉持小白鼠，使腹部朝上，右手持灌

胃器。灌胃器先从小白鼠口角插入口腔内，然后

沿着上颗壁轻轻插入食管，稍感有阻力时(大约

灌胃管插入1/2,相当于食管过膈肌的部位)，

即可推进注射器，进行灌胃(图1)。若注射器

推进困难，应重插。若灌胃器误插入气管给药，

可致小白鼠死亡。注药后轻轻抽出灌胃管。。

②小白鼠皮下注射法

通常在其背部皮下注射。将其皮肤拉起，注

射针刺入皮下，把针尖轻轻左右摆动，易摆动表

示已刺入皮下，然后注射药液。拔针时，以手指

捏住针刺部位，以防止药液外漏（图2）。。

③小白鼠静脉注射法

一般采用尾静脉注射法。事先将小白鼠或大

白鼠置于固定的筒内或铁丝罩内，或扣于烧杯

内，使其尾巴露出（图3）。将尾置于45-50C

的温水中浸泡或用75%的酒精棉球擦之，以使

血管扩张。然后，选择尾巴左、右两侧静脉进行

注射。注射时若出现隆起的白色皮丘，说明药物

未注入血管。这时，注射器应向尾根部位移动，

重新注射。。

图3小白鼠尾静脉注射法

④小白鼠腹腔注射法

以左手捉持小白鼠，让其腹部向上，右手将

注射器针头刺入皮肤，刺入部位距离下腹部腹白

线稍向左或右的位置（图4）。向前推进注射器

3-5mm„接着使注射针与腹部皮肤面呈45°刺

入小白鼠的腹肌，继续向前刺入，针头通过腹肌

进入腹腔后阻力消失,这时即可慢慢注入药液。O

⑤实验动物的标记

实验用较大动物如兔、猫、犬等可用特制的

号码牌固定于耳上。白色家兔和小鼠、大鼠，可

用黄色苦味酸（3%-5%）涂于毛上标号。其编号

方法无统一规定，以下方法可供参考。

如给小鼠标记-10号,可将小鼠背部分前肢、

腰部、后肢，按左、中、右分为九个区，从右到

左标记「9号，第10号不标记（图5a）。如给

小鼠标记1-20号，则（图b）。

1号-----右前肢11号------腰

部及右前肢

2号-----左前肢12号------腰部

及左前肢

3号-----左后肢13号------腰

部及左后肢

4号-----右后肢14号------腰

部及右后肢

5号-----头部15号------腰

部及头部

6号-----头部及右前肢16号------腰、

头部及右前肢

7号-----头部及左前肢17号------腰、

头部及左前肢

8号-----头部及左后肢18号------腰、

头部及左后肢

9号-----头部及右后肢19号------腰、

头部及右后肢

10号-----腰部（背中间20号------尾

根部

、大鼠皮毛标记编号法

(a)小鼠急性毒性测试

目的：

测定LDso了解受试物的毒性强度、性质和

可能的靶器官，为进一步进行毒性试验的剂量和

毒性观察指标的选择提供依据，并根据LD50进

行毒性分级。

结果判定：

①如LD50小于人的可能摄入量的100倍，则

放弃该受试物。如LD50大于或等于100倍者，

则可考虑进入下一阶段毒理学试验。

②如动物未出现死亡的剂量大于或等于

lOg/kgBW(涵盖人体推荐量的100倍)，则可

进入下一阶段毒理学试验。

③对人的可能摄入量较大和其它一些特殊原

料，按最大耐受量法给予最大剂量动物未出现死

亡，也可进入下一阶段毒理学试验。

范围：

本方法规定了急性毒性试验的基本技术要求。

术语和定义：

下列术语和定义适用于本方法。

①半数致死量(LD50)是经口给予受试物后，预

期能够引起动物死亡率为50%的单一受试物剂

量，该剂量为经过统计得出的估计值。其单位是

每公斤体重所摄入受试物质的毫克数、克数或毫

升数，即mg/kgBW、g/kgBW、mL/kgBWo

②最大耐受剂量法(MTD):用最大使用浓度和最

大灌胃容量给予2。只动物后，连续观察7.14天,

未见任何动物死亡，则MTD大于**g/kgBWo

原理

经口一次性给予或24h内多次给予受试物

后，在短时间内观察动物所产生的毒性反应，包

括致死的和非致死的指标参数，致死剂量通常用

半数致死剂量LD50来表示。

实验动物

一般均分别用两种性别的成年小鼠或大鼠。小

鼠体重为18.22g,大鼠体重为180-220g。如对

受试物的毒性已有所了解，还应选择对其敏感

的动物进行试验，如对黄曲霉素选择

雏鸭。动物购买后适应环境3-5天。

操作步骤

①受试物的处理：

受试物应溶解或悬浮于适宜的介质中。一般采

用水或食用植物油作溶剂，能够考虑用竣甲基

纤维素、明胶、淀粉等配成混悬液；不能配制

成混悬液时，可配制成其它形式（如糊状物

等）。必要时可采用二甲基亚碉。但不能采用

具有明显毒性的有机化学溶剂。如采用有毒性

的溶剂应单设溶剂对照组观察。

②受试物的给予

途径:经口。

试验前空腹:动物应隔夜空腹（一般禁食16h

左右，不限制饮水）。

容量:各剂量组的灌胃容量相同（ml/kg

BW）,小鼠常用容量为20mL/kgBW；大鼠常

用容量为10ml/kgBWo

方式:一般一次性给予受试物O也可一日内多

次给予（每次间隔4・6h,24内不超过3次，尽

可能达到最大剂量，合并作为一次剂量计算）。

常用的急性毒性试验设计方法

霍恩氏（Horn）法

预试验:可根据受试物的性质和已知资料，

选用下述方法:、1和10g/kgBW的剂量，各以2.3

只动物预试。根据24内死亡情况，估计LD50

的可能范围，确定正式试验的剂量。也可简单地

采用一个剂量，如215mg/kgBW,用5只动物

预试。观察24h内动物的中毒表现。如症状严重,

估计多数动物可能死亡，即可采用低于

215mg/kgBW的剂量系列，反之症状较轻，则

可采用高于此剂量的剂量系列。如有相应的文献

资料时可不进行预试。

动物数:一般每组用5只。

常用剂量系列：

X10lt=O,±l,±2,±3

XIOtt=0,±l,±2,土3为小，所以结果

较为精确。一般试验时，可根据上述剂量系列设

计）个组，即较原来的方法在最低剂量组以下或

最高剂量组以上各增设一组，这样在查表时容易

得出结果。

正式试验：

将动物在实验动物房饲养观察3-5天，使其

适应环境，证明其确系健康动物后，进行随机分

组。给予受试物后一般观察7或14天，若给予

后的第4天继续有死亡时，需观察14天，必要

时延长到28天。记录死亡数，查表求得LD5o,

并记录死亡时间及中毒表现等。

该方法的优缺点:优点是简单易行，节省动

物；缺点是所得LD50的可信限范围较大，不够

精确。但经多年来的实际应用与验证，同一受试

物与寇氏法所得结果极为相近。因此对其测定的

结果应认为是可信与有效的。

最大耐受量试验：

适宜条件:有关资料显示毒性极小的或未显

示毒性的受试物，给予动物最大使用浓度和最大

灌胃容量的受试物时，仍不出现死亡。

动物:至少雌、雄各10只。

剂量:受试物最大使用浓度和灌胃容量(一个

剂量组)。

方法:动物购买后观察3-5天，给予最大使用

浓度和最大灌胃容量的受试物(一日

内1次或多次给予，一日内最多不超过3次)，

连续观察7.14天，动物不出现死亡，则认为受

试物对某种动物的经口急性毒性剂量大于某一

数值(g/kgBW)o最大灌胃容量小鼠为20mL/kg

BW,大鼠为20mL/kgBWo

(b)小鼠体内抗肿瘤活性测试

体内试验用于确认受试物对特定类型肿瘤细

胞的杀伤或抑制作用，探索受试物产生药效作用

的给药剂量、途径、频率、周期等。体内试验

通常采用动物肿瘤移植模型和人癌移植模型。

由于动物肿瘤移植模型与临床疗效之间的相关

性不强，仅可用于侯选化合物的初步筛选。通常

情况下，以人癌移植模型试验结果来评价抗肿瘤

药物的有效性。

1、模型建立

细胞毒类抗肿瘤药物临床前体内试验一般

至少应选用6种人癌移植瘤模型，其中应包括

II期临床试验中拟筛选的肿瘤组织类型。模型

的建立和使用应注意：移植瘤复苏后一般应传

2-3代后再用于体内抗肿瘤试验；为了保持移植

瘤的生物学特性和遗传特性，复苏后移植瘤体内

传代应少于15-20代。

2、试验设计

肿瘤移植部位主要在皮下，也包括腹腔、肾

囊下和原位等。通常待移植肿瘤生长至

100-300mm3后将动物随机分组给药。一般包括

高、中、低3个剂量的治疗组、阳性对照组和

阴性对照组。治疗组受试物剂量的选择应能够体

现出药物的量效关系，高剂量不宜超过受试物

的最大耐受剂量。应根据受试物的药动学特点

和毒性反应等确定给药频率和周期；给药途径应

尽量与推荐临床用药的途径相同。阳性对照药一

般应满足以下条件：（1）与受试物作用机制相同

或相近；（2）对移植肿瘤敏感；（3）临床广泛

应用且疗效确切。阳性对照药的给药方案应能够

体现出药物的最佳治疗作用，其剂量一般不宜超

过最大耐受剂量。阴性对照组给予相应的溶剂。

3、检测指标

推荐使用测量瘤径的方法，动态观察受试物

的抗肿瘤效应。肿瘤直径的测量次数根据移植瘤

的生长情况而定，一般为每周2-3次。在试验

中还应该观测与药物安全性有关的指标，如动物

体重增长和死亡率，将治疗组的这些数据与标准

治疗对照组进行比较，对于判断药物的安全性和

开发前景具有重要的意义。试验中应记录检测

指标的变化与给药时间的关系，以便了解药物的

作用特点，减少单次记录试验结果可能引起的误

差。体内抗肿瘤试验结果中还应同时附有相应的

照片。

4、评价标准

对于体内试验结果的评价应综合考虑受试

物的作用机制、模型的临床相关性、每一种模

型的具体试验结果以及受试物与阳性对照药物

试验结果的比较。

针对每一种人癌移植瘤模型，推荐采用相

对肿瘤增殖率T/C(%)作为试验评价指标，评

价标准通常为:T/C(%)>40%为无效；T/C(%)

・40%,并经统计学处理P＜为有效。在体内

有效性试验采用的全部人癌移植模型中，一般至

少应有1/3达到有效标准，才提示药物有必要

进入临床试验。

在评价时还应关注受试物与阳性对照药试

验结果的比较。在毒性相当(在有效性研究中主

要表现为动物体重下降相当)的情况下，对受试

物治疗组和阳性对照药组肿瘤增殖率的比较也

是评价受试物是否有必要进入临床试验的指标

之一。

附：

①相对肿瘤增殖率T/C(%):针对每一种

人癌移植瘤模型的抗肿瘤活性评价指标。计算公

式如下：T/C%=TRTV/CRTV*100%o(TRTV：治疗组

RTV；Cm阴性对照组RTV)。

②肿瘤体积(tumorvolume,TV)的计算公式

为:V=l/2XaXb2或冗/6XaXbXc。其中a、

b、c分别表示长宽高。由于此两公式的相关性

极好，可采用任一公式。根据测量的结果计算出

相对肿瘤体积(relativetumorvolume,RTV),

计算公式为：RTV二Vt/V0o其中V。为分笼给药

时(即d。)测量所得肿瘤体积，X为每一次测量时

的肿瘤体积。

鼠S180移植瘤的抑制作用实验

1材料与方法

材料

实验用药物

动物及瘤株

肉瘤Si正实验用昆明小鼠18-22go

仪器设备

灌胃器、手术器械、天平、离心机

方法

肿瘤模型建立

小鼠s⑸细胞接种于昆明种小鼠腹腔后，

取腹水传代保存。取腹水传代第7日荷瘤小鼠,

脱颈椎处死小鼠，消毒腹部皮肤，无菌注射器

吸取乳白色腹水，用生理盐水调整肿瘤细胞浓

度为1X107/疝，用酒精棉球消毒昆明种小鼠

右侧腋下皮肤，于皮下接种上述瘤细胞悬液

（mL/只），常规饲养。

药物对小鼠S18。的抑制作用

昆明种小鼠50只，腋下接瘤，次日将荷

瘤小鼠随机分为5组，每组10只。分别为模

型组、环磷酰胺（CTX）组、药物高、中、低

剂量组。干后,称取瘤重，，计算抑瘤率:小鼠

接瘤后第二日开始按表1所示剂量和方式给

药，CTX组于接瘤后第2日给药，隔天一次，

药物组每日给药一次，连续10天，ml/20g

体重。末次给药24小时后，脱颈椎处死小鼠，

剥取瘤组织，去除血污、脂肪等非肿瘤组织，

用滤纸吸

抑瘤率%=（1—给药组平均瘤重/对照组

平均瘤重）X100%

表1荷瘤小鼠给药剂量和方式

剂量（mg/kg

组别给药方式

B.W.）

模型一一

CTX20腹腔注射

高一灌胃

中灌胃

药物

低灌胃

对荷瘤小鼠免疫器官的影响

动物接种S18。瘤株为第0天，第1天开始

灌胃，连续灌胃10天，第11天处死动物，

准确称量动物体重、胸腺重量、脾脏重量，计

算胸腺指数和脾脏指数，脏器指数二脏器重量

/体重。

表2药物对免疫指数的影响&±s）

胸腺指

剂量动物脾指数

数

组别(mg/kg数(1X1

(1X10-

B.W.)（Z7）0-3)

3)

空白

—>10

对照

20

CTX10

i.p.

—10

药物—10

—10

取部分瘤组织用10%中性甲醛固定，石蜡

包埋，切片，经苏木精一伊红染色，

光镜观察。

实验步骤

①固定液、染色液的配置

固定液：

(1)10%中性福尔马林。

甲醛100ml

NaH2P04H2O4g

Na2HPO413g

蒸福水900ml

(2)Harris苏木素：

配方：

苏木素1g无水乙醇10ml

蒸镭水200ml钾明研20g

HgOg

先将苏木素溶于无水乙醇中，备用。把明矶

放入蒸偏水，加热溶解，再加入备用的苏木素，

煮沸2分钟，先加入少量的氧化汞，防止氧化

过程中苏木素外溢，玻棒搅拌，然后，边搅拌边

加入氧化汞。加完后，立即移至冰水中，加速其

冷却，静置一夜后，过滤。用前以5%的比例

加入冰醋酸。

⑶伊红（醇溶性）

配方：

伊红（醇溶性）

75%酒精1000ml

加几滴冰醋酸至半透明状。

伊红有水溶的和醇溶的，如果用的是水溶的，应

该在脱水前进行染色，如果是醇溶的，应使用与

溶解伊红等浓度的酒精开始脱水。

（4）盐酸酒精分化液：

浓盐酸〜1ml

75%酒精99ml

⑸蛋白甘油：

蛋白甘油是粘贴蜡片用的粘片剂。配方如下:

取一新鲜鸡蛋的蛋白，充分搅拌成雪花状泡沫，

然后滤去泡沫，加入等量甘油，搅拌均匀，再加

入一小粒麝香草酚防腐。

②实验用具:解剖器一套、单面刀片、切片刀、

切片机、载玻片、盖玻片、标本瓶、烧杯、量筒、

漏斗、染色缸、树胶瓶、酒精灯、毛笔、绘图纸、

滤纸、熔蜡箱（或恒温箱）、展片台（或烫板）、

小木块、蜡带盒、烤片盒、切片托盘。

③病理标本的采集和制作

⑴取材

脱颈椎处死小鼠，剥取瘤组织，去除血污、

脂肪等非肿瘤组织。

⑵固定与修块

迅速将胰腺放入4%中性甲醛（用PH）中固

定48小时,组织块的直径应小于7mm。

⑶脱水与透明

在以下过程，要求经常晃动组织块，以保证

组织块能够充分地与乙醇或二甲苯接触，在每一

步骤之后，要充分滤干组织块，一般用筒纸吸干

组织块上的液体，以免影响其它液体的浓度，但

要防止组织块干燥。（270miii）o

1.75%乙醇

50min

2.85%乙醇

50min

3.95%乙醇（I）

30min

4.95%乙醇（ID

30min

5.100%乙醇（I）

30min

6.100%乙醇（II）

30min

71/2二甲苯（乙醇与二甲苯等体积）

20min

8.二甲苯（I）

20min

9.二甲苯（II）

lOmin（可依据透明效果而定）

透明效果的判断:如组织块颜色加深透明,

二甲苯溶液颜色透明，即表明脱水效果很好；如

脱水不好，二甲苯溶液颜色会变混浊。使用过的

酒精或二甲苯倒入烧杯里以便回收。

(4)浸蜡、包埋与修蜡块

1.浸蜡:可在脱水与透明进行时，将60℃

恒温箱打开，使大烧杯内的石蜡充分溶解，待脱

水与透明结束后，可将脱水篮整个或包裹在纱布

内的组织块转入充分溶解的石蜡里，于60c恒

温箱放置120分钟。

2.包埋:包埋有多种器具，比较简洁廉价

的方法是采用纸盒。可在浸蜡的同时将纸盒做

好，包埋时将60℃的石蜡倒入纸盒内，然后用

小镣子将各组织块按一定的顺序排列好，使切面

朝下。我们建议，不同组别的同一组织包埋于一

个蜡块中，以保证切片和染色条件一致，且以便

读片和比较。为防止倒入纸盒内的石蜡底部立刻

凝固，可将纸盒置于一玻璃板上(或大培养皿

内)，然后将玻璃板置于80-90℃左右热水上，包

埋时蜡盒底部要放平，做蜡块的蜡要反复冻融较

好。组织包埋方法可参见表2。

3.修蜡块:待纸盒内蜡凝固后（若需要使蜡

块迅速凝固，可将包埋好的蜡块置于4c冰水混

和物中）。将蜡块取出，用刀片将其修成梯形，

通常蜡块大小视组织多少而定，为保证切片顺

利，组织块与蜡块边缘之间的距离不得小于

2mmo修剪下来的残蜡应回收，以便再用。

⑸切片

在载玻片上擦少量甘油蛋白。可滴半滴甘油

蛋白于载玻片上，用手指充分抹匀，呈半干状为

佳。

切片厚约4〜即m,通常厚约6pm,细胞小

而密的组织如胸腺，能够切4〜5RH,而细胞疏的

组织，如下丘脑可切将切片在55c左右

水浴中展开，展开程度以带黄颜色的组织完全摊

平为准。

用涂有甘油蛋白的载玻片从水浴中捞取切

片，斜放在木架上，立即放入37℃烘箱中过夜,

一般时间越长效果越好，以切片紧贴于载玻片上

呈半透明状为佳。每个组织块捞片2张。

过夜后，将载玻片置于玻片架上，进行下

面的实验。

⑹脱蜡、染色与脱水

取出玻片架后，应将玻片架倾斜，以使载

玻片上的试剂流尽，然后用筒纸将玻片架和载玻

片下缘的试剂吸干，以免影响其它试剂的浓度。

全过程约需要50mino

1.脱蜡到水

(1)二甲苯(I)15分钟

(2)二甲苯(II)15分钟

(3)100%乙醇2分钟

(4)95%乙醇(I)1分钟

(5)95%乙醇(II)1分钟

(6)蒸镭水浸洗1分钟

2.染色

(7)苏木精30秒钟

(8)自来水冲洗1分钟，但应注意不能用

水直接冲在玻片上，以免冲走切片。(显微镜下

观察效果)

(9)伊红(着色即可)10秒钟

(10)蒸馈水浸洗1分钟

3.脱水

(10)95%乙醇(I)1分钟

(11)95%乙醇(II)1分钟

(12)100%乙醇2分钟

(13)二甲苯(I)2分钟

(14)二甲苯(II)3~5分钟

⑺封片

将载玻片从玻片架上取下，滴加1~2滴中

性树胶，用眼科镜夹住盖玻片的一角，轻轻盖上

盖玻片，让中性树胶沿着盖玻片充分展开，之后

倾斜载玻片，用筒纸将多余的中性树胶吸干，同

时注意避免有气泡的产生，平放载玻片，室温下

长期保存。

数据处理

所有实验设3个平行组或重复3次，结果

以as表示，用SPSSo

注意事项

①关于腹水传代，观察到第一代的种鼠肚子较大

后（一般约8-9天左右），能够传代，传代时取

1ml注射器，用2ml注射器的针头，种鼠腹部消

毒后直接将针头插入抽取腹水即可，注意不要

把针头插得很深，尽量浅一点，还能够把老鼠拎

起来，利用重力，让腹水集中在某处便于抽取，，

不用离心，直接用PBS3-6倍稀释后，接种到

新的老鼠腹腔，腹水颜色为白色或者略有发黄都

是正常的，但是血性腹水说明不好，需要注意调

整，第二代以后，尽量6-7天的时候传代，不要

等的时间太久，否则腹水容易血性。三代后可用

于试验。

②关于接种进行试验，这个时候抽取的腹水需要

量比较多，一般需要处死种鼠后，小心地用消毒

眼科剪刀镜子剥开腹部皮肤，注意不要弄破肌

肉，然后，用镜子拎起腹部的肌肉，用剪刀剪开

一个小口，然后用玻璃滴管或者去掉针头的注射

器吸取腹水。稀释后，接种到小鼠的腋下。关

于稀释量，最好摸索一下，开始的时候能够适当

的计数，污染。但是要用台盼兰染色后计活细胞

数。接种部位在小鼠腋下，但是不要深入到腋

窝里面，会给以后的操作带来麻烦。接种时的进

针处离接种处远一点，让针头在皮下多走一段，

不容易

③细胞接种量控制在1X106/只时，小鼠腹水出

现情况一般如下：5〜6d出现腹水，7〜9d抽取

传代最好，10-12d出现血性腹水，14〜15d

小鼠开始死亡。

④如果动物固定不佳，注射肿瘤细胞时针头在

皮下来回游动，结果是肿瘤长成后不能成为一

个球形或半球形，而是成为有几个小瘤体组成

的长条或者不规则形状。

⑤关于观测指标，主要是按时称体重，试验结束

后剥取肿瘤称瘤重。因为出瘤已经是接种后的第

6天左右了，第10天就结束时间，瘤体积的数

据意义就不大。按照SFDA的规定，平均瘤重小

于1g,或者单个瘤重小于200mg,认为肿瘤生

长不良，试验作废。

(d)体外实验法:用培养的肿瘤细胞系进行。

体外试验主要用于对候选化合物进行筛选，

初步了解受试物的作用机制、敏感肿瘤类型和作

用强度，为随后进行的体内试验提供参考。

在体外培养的不同人肿瘤细胞系中加入不

同浓度的待测药物，采用磺酰罗丹明染色法

(SRB法)、四氮咬盐还原法、集落形成法等

方法进行检测，计算药物的半数抑制浓度

(IC50),并与标准治疗药物进行比较，能够

初步预测抗肿瘤药物的抗瘤谱和作用强度。应根

据化合物的结构特点和作用机理确定体外试验

采用的研究方法。例如，以线粒体为作用靶点

的药物不宜采用四氮咬盐还原法。

试验中，在选择肿瘤细胞系时应考虑到细胞

的生长和增殖速率，一般至少应选用12种人癌

细胞系。药物与细胞共培养的时间一般为48~72

小时，贴壁细胞需先贴壁24小时后再给药。试

验应设阳性及阴性对照组，阳性对照为标准抗肿

瘤药，阴性对照为溶媒对照。试验至少应重复一

次。

1、嘎哇蓝(MTT)法在培养的活细胞线粒

体中与NADP相关的脱氢酶可将黄色的四氮哇

(MTT)催化成不溶性的蓝紫色的甲替，将甲

替用二甲基亚碉(DMSO)溶解后，利用酶标仪

(试验波长570nm,参比波长450nm)测定光

密度值，按照公式

实验组

光密度值

肿瘤细胞生长抑制率(%)=(1

-)X100%

对照组

光密度值

计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率。用系列浓

度的药物可制作肿瘤细胞生长抑制率的量效曲

线。

2、染料排斥法本方法是根据活细胞具有排

斥某些染料的功能，而死细胞因胞膜破坏而易于

被染料着色的原理，在培养的对数生长期的细胞

悬液中加入伊红、台盼蓝、或苯胺黑等染料，在

室温下放置5分钟后，在15分钟用血球计数板

计数200个细胞。根据公式

未染细胞数

活细胞率—X100%

细胞总数

3、生长曲线法本方法是根据肿瘤的

Gompertzian生长曲线而设计。培养的肿瘤细胞

在初期为指数增殖期，随着细胞密度的增加，因

代谢产物的积聚和营养物质的消耗，增殖趋于减

缓乃至停止，进入所谓的平台期。在培养后的的

即刻、1、2、3、4、5、7天的细胞，用台盼蓝

染色，细胞计数，然后取细胞对数对培养时间作

图可获细胞生长曲线。1）将生长曲线外延至Y

轴可获得截距No,,用公式

对增殖细胞的杀伤力=N°-WX100%

No

计算药物对增殖细胞的杀伤力（No'是对照组

的的截距）

2）用Nt代表接种后t小时的细胞数，用公

式

TD=/logNt-LogNo

计算药物对细胞增增时间（TD）的影响。

3）取平台期每毫升的细胞均数，比较细胞生

长的饱合密度（Ns）。

4、集落形成法本方法利用分裂济代以上的

克隆原单细胞子细胞可形成集落成簇（每簇细胞

数＞50）的能力，比较药物对单个肿瘤细胞增殖

能力的影响。本方法有贴壁法和半固体培养法两

种。

1）贴壁法需要选用贴壁生长的细胞，按

500细胞/ml的浓度接种到35mm培养皿中，培

养后弃去培养基，用瑞氏-姬姆萨染色后，在20

X解剖显微镜下计数含有50i个细胞的细胞集

落。

2）半固体软琼脂培养法取对数生长的细胞,

用含小牛血清的培养液稀释成1000细胞/ml的

悬液；溶化5%的琼脂液，并按1:9的比例与含

小牛血清的新鲜培养液混合,倒入35mm培养皿

（Iml/HIL）,室温下待琼脂凝固，,%琼脂,加到

已制备的琼脂平皿中，室温下凝固。移入培养箱

培养。在16X解剖显微镜下计数直径大于75U

m的细胞集落。以集落形成抑制百分率对对数剂

量作图，可得型曲线，从曲线上求取半数

抑制浓度IC50；以集落的存活分数与剂量作图，

可获得克隆原细胞存活曲线，方程为

S=l-(Le・D/Do)n,S为存活分数，D为剂量，Do

为存活分数每下降1/e时所需的药物剂量，n

为外推值。D。越小，药物的杀伤力越大，N越

大杀死细胞的药物剂量越大。

5、硫化若丹明B法(SRB)法硫化若丹明

(sulforhamineB)呈粉红色，溶于水，可与生

物大分子的碱性氨基酸结合，这种结合物在波长

515nm时的读数与细胞表现出良好的线性关系，

可用于细胞的定量。测试的细胞先用TCA固定,

去除固定液，加入SRB,室温下静置，然后

去除未结合的SRB,用非缓冲tris碱液溶解结

合的SRB,在自动化分光光度平板读数仪

(515nm波长)测定OD值。可根据下述公式计

算：

T-To

生长率07=X100%

C-To

C、T和To分别为对照组细胞，为给药组细

胞，另外的对照平板加药时的细胞的OD值。

T-To

杀伤率(％)=X100%

T

To

50%生长抑制所需的药物浓度(GI50)=

X100%

C-

To

To

杀死50%细胞所帝的药物浓度(LC5O)二

X100%

To

(e)抗肿瘤作用机理的深入研究

(一)药物作用周期特异性研究

进行药物作用细胞周期性实验必须首先制备

同步化的细胞，常用的体外培养细胞同步化的方

法有机械振荡法、双胸昔同步法、含羞草氨酸俘

获法和离心洗脱法。

1、机械振荡法机械振荡法分离同步化细胞

是基于单层贴壁生长的细胞在进入有丝分裂期

时，胞形变圆，松散地附在支持物上，利用摇晃

或拍击培养瓶能够剥离出这些细胞，利用此方法

能够得到较纯的M期细胞。双胸昔同步法的原

理是先以高浓度的TdR处理细胞，使细胞内的

dTTP升高，后者抑制CDP向dCDP的转变，

DNA复制受阻，S期细胞停滞在S期，其它期

细胞积聚在Gi/S边界；撤TdR,让原处于S期

的细胞完全越过S期，再给予TdR,让越过S

期的细胞进入Gi/S边界，然后撤去TdR,让细

胞重新生长，同时进入S期。因此，本方法能够

得到较纯的S期细胞。

2、含羞草氨酸俘获法含羞草氨酸可将细胞

集结于Gi/S边界，阻止细胞进入S期。在撤除

含羞草氨酸后，细胞可同步进入S期。

3、离心洗脱法离心洗脱法的原理是进入细

胞周期的的体积呈线性增加。Gi期细胞体积最

小，离出口最近而被最先洗出。G2/M细胞体积

最大离进气口最近而被后洗出。

在上述同步化处理尚需配合以同步化程度的

检测，检查的方法有两种:流式细胞光度技术和

放射性同位素技术。前者通过测定细胞的荧光强

度来定量细胞的DNA量；后者则利用测定掺入

到DNA中的3H.胸昔(3H-TdR)或漠脱氧尿昔

(BrdU)的量来获知处于S期的细胞量。

(二)药物抗微管作用利用微管蛋白在

37℃聚合，在冰浴上解聚的特点，测定微管蛋白

或微管液的OD值，分别获得S型的聚合曲线和

倒S型的解聚曲线，比较药物对曲线的影响，

用下式计算抑制率。

实验组光密度值

抑制率(%)=)X

100%

对照组光密度值

（三）药物与DNA结合能力检查

吸收光谱移动法原理是DNA与药物形成复

合物后吸收光谱发生改变，吸收峰产生位移，位

移波长随DNA/药物复合物的量增加而增加。

利用紫外分光光度计进行紫外吸收光谱扫描，可

观察到这些改变。

荧光光谱移动法原理是在激发光的激发

下，DNA.药物复合物的荧光发射光谱发生改变,

谱峰向短波方向移动，荧光强度增强，同时激发

光谱说发生改变。用荧光分光光度计测定激发光

谱和发射光谱可观察到这些变化。

（四）药物造成的DNA损伤

彗星（Comet）微凝胶单细胞电泳法正常的

DNA为负超螺旋结构，在pH<,在pH>oDNA

受损后链断裂，成为一个松散的结构，在电场的

作用下，松散的DNA离开细胞核向正极移动，形

成彗星似的拖尾，变换不同pH缓冲液可检测断

裂的是双链还是单链。

碱洗脱法收集细胞于滤膜上，用细胞溶解

液裂解细胞并洗去RNA和蛋白质，暴露DNA,

用洗脱液进行洗脱，若DNA发生链断裂，则易

于经滤膜洗出。

（五）药物对DNA拓扑异构酶的影响

DNA拓扑异构酶是调节DNA空间结构的

动态变化的关键性核酶,分成拓扑异构酶I和IL

抑制拓扑异构酶I能够造成DNA的单链断裂，

抑制拓扑异构酶H,可造成双链断裂，进而干扰

DNA的复制、重组和基因表达。实验的原理是

用从肿瘤细胞核提取的拓扑异构酶II处理

PBR322DNA,后者是一种质粒DNA,主要存在

有超螺旋、缺口状和线性DNA三种形式，琼脂

糖电泳上显示出三条带，在拓扑异构酶的作用下

超螺旋DNA解旋、断裂，电泳时超螺旋带减弱

或消失，相应的缺口环状或线性DNA增加。如

果药物对拓扑异构酶具有抑制作用，则可见超螺

旋带保留。此方法亦可改进为观察药物对拓扑异

构酶功能的促进和抑制作用。方法是选定不能使

一定量DNA完全断裂量的拓扑异构酶处理

PBR322DNA后电泳可见超螺旋带，同时加入不

同浓度的药物，如果药物抑制拓扑异构酶，则超

螺旋带增强，若药物增强拓扑异构酶活性，则见

螺旋带减弱或消失。

（六）药物对细胞核酸代谢的影响DNA和

RNA合成均需要特殊氨基酸，用同位素标记前

体物如3H-TdR,3H-UR可分别掺入到细胞DNA

和RNA中去，用液闪法测定其同位素活性则可

知细胞DNA和RNA的合成情况。

（七）药物对肿瘤细胞凋亡的诱导作用

细胞凋亡是一种受基因调控的细胞程序性死

亡过程，细胞凋亡时表现为细胞体缩小，染色质

浓缩成大小不等的块状，并裂解为小片段。DNA

断裂长度为核小体核甘酸长度（180〜200碱基对）

的整倍数，提取后普通的琼脂糖电泳表现为特殊

的云梯状，凋亡小体形成。检查细胞凋亡的方法

有：

1、荧光显微镜的形态学检查该方法是利用

凋亡细胞染色质浓缩，DNA广泛裂解的特征和

荧光化合物可嵌入DNA分子或以静电相互作用

与DNA分子结合的原理，建立DNA的荧光探

针。常用的方法是用Hoechst33342和PI联合染

色，然后在荧光显微下用紫外光激发。凋亡的细

胞对Hoechst33342具有高摄取比，加之染色质

的高度浓缩，呈强蓝色荧光；正常细胞呈微弱荧

光，坏死细胞则呈红色荧光（被PI染色）。

2、流式细胞光度术该方法的原理是用

DNA结合性的荧光染料标记DNA,因为细胞

发生凋亡时，内源性核酸内切酶降解、断裂

DNA,断裂生成的小分子量DNA溢出细胞外，

细胞内DNA总量降低，利用流式细胞光度术能

够检测出DNA的这种结构和量的变化。

3、琼脂糖电泳分析法利用该方法可检测出

呈云梯状的寡聚核小体。

(g)动物体内药物代谢动力学实验

了解受试物在体内的吸收、分布和排泄速度

以及蓄积性，寻找可能的靶器官:为选择慢性毒

性试验的合适动物种、系提供依据：了解代谢产

物的形成情况。

范围

本方法规定了代谢试验的基本技术要求。

本方法适用于评价我国创新的化学物质，或

需要进行三个阶段毒性试验包

括已知化学物质或与已知化学物质结构基本相

同的衍生物在体内的代谢转化途径及转归。

原理

受试物在体内可发生一系列复杂的生化变

化。受试物经胃肠道吸收后通过血液转运到全

身各组织器官，再经过生物转化，由各种途径排

出体学结构，测试其毒性并推测受试物在体内的

具体代谢途径。通过本实验的观察，对受试物在

体外。因此，受试物原形物在逐渐被代谢降解，

而其代谢产物不断生成。测定灌胃后不同时间内

受试物原形物或其代谢物在血液、组织或排泄物

中的含量，以了解该受试物在动物体内的毒代动

力学特征，包括吸收、分布、消除的特点，组织

蓄积及可能作用的靶器官等，根据数学模型，求

出各项毒代动力学参数。同时采用分离纯化方法

确定主要代谢产物的化内的过程可作出正确评

价，为阐明该受试物的毒作用性质与程度提供科

学依据。

仪器与试剂

根据实验室条件，配备高效薄层色谱、高效液

相色谱、气相色谱、气质联用及紫外光、荧光检

测等仪器设备。

放射性测量仪器:液体闪烁计数仪及闪烁液。

实验室常用仪器与试剂。

试验动物

原则上应尽量使用与人具有相同代谢途

径的动物种系。一般选用两种性别、体重为

22-28g成年小鼠或170-220g大鼠。试验开始

时动物体重的差异应不超过平均体重的

±20%o

剂量及分组

选用低于最大未观察到有害作用剂量，需要时

可用高、低二种剂量。可单次或多次给予受试

物。如采用标记化合物，除确定化学剂量外，

放射性剂量一般小鼠为10・20PCi/只。、大

鼠100-250UCi/kg（4-9MBq/只）。

操作步骤

①受试物配制:一般用蒸镭水作溶剂，如受试物

不溶于水，可用食用油、医用淀粉、竣甲基纤维

素配成乳浊液或悬浊液。受试物应于灌胃前新鲜

配制，除非有资料表明以溶液（或悬浊液、乳浊

液等）保存具有稳定性。

②给受试物途径：以灌胃为主，灌胃前动物禁食

16-18h,自由饮水。进行毒代动力学分析

时，最好同时采用灌胃和静脉注射。

③试验项目：进行代谢试验前，需建立测定生物

样品中受试物含量的微量化学分析方法或

标记受试物的同位素示踪方法。

:于动物灌胃后6・10个不同的时相采血，每

个时相的动物数不应少于3只。结果以每mL血

浆中受试物含量或放射性强度为纵坐标，时

间为横坐标，在半对数纸上作药-时曲线。如以

化学分析方法测定受试物含量，用已编制的药代

动力学计算机程序进行曲线拟合，按房室模型求

出毒代动力学方程及各项代谢动力学参数。如用

同位素示踪法测定血浆总放射性水平，作代谢动

力学分析时应谨慎。

:于灌胃后不同时间处死动物，取出胃肠道及其

内容物（包括粪）作成匀浆，

测定受试物含量或放射性水平，以灌胃后即刻处

死动物的胃肠道回收量为100%,分别观察不同

时相的各组动物中受试物或放射性自胃肠道消

失的情况。以上述不同时相回收量的百分数为纵

坐标，时间为横坐标，在半对数纸上作图，求得

受试物或放射性在胃肠道的消失速率。为确定受

试物在胃肠道的消失速率是否能反映在体内的

吸收情况，需进行离体胃肠道温孵试验，即将受

试物注入离体胃肠道后结扎两端，于37c

Kreb飞液中振荡温孵lh,测定受试物的回收率,

以观察受试物在胃肠道内有无受到破坏，由此估

计受试物在胃肠道的吸收速率。

:于灌胃后取-.!个不同时相处死动物，对肝、肾、

脑等器官

和组织进行受试物含量或放射性测定，以找出受

试物含量最高的组织和时间。

⑴尿、粪排泄:给动物灌胃受试物后放入有机玻

璃代射笼内，于3・7天内按规定时间收集尿和粪。

如发现尿粪互混，则把标本弃去再另收集。作代

谢产物结构分析时应把收尿容器放在冰浴中并

注意避光。

⑵胆汁排泄:轻度乙酸麻醉下给动物施行胆道插

管，待动物清醒后以受试物灌胃，收集

不同时间的胆汁（不少于24h）。

从不同时间收集的尿、粪、胆汁标本中的受

试物含量或放射性强度，分别计算其累积排出量

（占灌胃剂量的百分数）。

:按受试物的化学结构和文献资料，估计可能产

生的代谢产物。给动物以受试物后，收集尿、胆

汁等标本，或在体外代谢条件下采用肝微粒体、

酶活性系统和受试物于37c振荡培养，以提取、

纯化后进行代谢物的结构鉴定。分析手段包括薄

层色谱、气相色谱、液相色谱、质谱、红外光谱

等。要有预测的代谢物纯品作标准。如采用标记

化合物，样品经薄层色谱分离后用放射性薄层扫

描仪或分段刮下硅胶测定放射性，由Rf值判定

并测量受试物的量及可能的代谢产物，再作进一

步分析。从代谢物的分离与鉴定，对受试物在体

内的可能代谢途径作出推断。

④同位素实验中的注意事项：同位素方法是毒物

代谢实验中不可缺少的手段之一，常列为首选的

实验方法，它具有灵敏度高、样品制备较简单、

不易受生物材料中杂质的干扰，能够示踪观察受

试物进入体内后的归宿等优点，结合化学分析法

如薄层色谱、液相色谱法，可把原形物和代谢物

分开以初步确定代谢物的可能存在形式。用放射

自显影法可定位观察受试物和代谢产物在整体

动物或某些组织中的分布定位。

⑴标记核素：由实验目的、受试物分子结构、半

衰期、经费等因素而定。

⑵标记位置:应标记在受试物结构中具有生物

活性的基团上，即定位标记。如生物活性基团

不清楚，由可采用均匀标记或全标记。标记位

置在化学结构上应是稳定的。按不同研究目

的，可单标记、双标记或多标记。

⑶放射化学纯度:标记物应保证高度的放化纯

度（至少90%以上），必要时用薄层色谱

法进行纯化。

⑷放射性比度:随受试物毒性大小而定。毒性

大的受试物，要求高放射性比度的标记物。用

非标记受试物稀释配制成实验所要求的化学

剂量。

:代谢试验常用的标记放射性核素大都属软B

射线，测量食品主要

为液体闪烁计数仪。

⑴样品制备:酸消化法。、、（粪加水制成匀

浆液,或粪红外灯烘干后研磨成粉，）两份，一

80c水浴消化45min,加蒸储水定容至1mL,,

加入3・5mL闪烁液进行放射性测量（胆汁、

尿离心后可直接取样测量）。有条件者可用固

体闪烁晶体。

⑵样品测量法:均相测量法。样品经淬灭校正

后，以每克组织或每毫升血浆中每min放射性

衰变数（DpM）表示。

⑶放射性测量误差:放射性测量的相对标准误

差应不超过5-10%o

⑤对生物样品中受试物分析方法的要求:建立一

个灵敏、特异、重现性好的测定方法。

结果判定

①根据吸收速率、组织分布以及排泄情况，估计

受试物在体内的代谢速率和蓄积性。

②根据主要代谢物的结构及性质，推断受试物在

体内的可能代谢途径以及有无毒性代谢物的生

成情况。

（h）动物亚急性，长毒实验

了解经长期接触受试物后出现的毒性作用

以及致癌作用；最后确定最大未观察到有害作

用剂量和致癌的可能性，为受试物能否应用于保

健食品的最终评价提供依据。

慢性毒性试验所得的最大未观察到有害作用剂

量进行评价的原则是：

①最大未观察到有害作用剂量小于或等于人的

可能摄入量的50倍者，表示毒性较强，应放弃

该受试物。

②未观察到有害作用剂量大于50倍而小于100

倍者,经安全性评价后，决定该受试物是否可用。

③最大未观察到有害作用剂量大于或等于100

倍者，则可考虑允许使用。

范围

本方法规定了慢性毒性和致癌试验的基本技

术要求。

术语和定义

最大未观察到有害作用剂量（NOAEL）:是

指通过动物试验，以现有的技术手段和检测指标

未观察到与受试物有关的毒性作用的最大剂量。

靶器宫:实验动物出现由受试物引起的明显

毒性作用的任何器官。

致癌性:实验动物每日重复暴露于受试物导致

肿瘤的发生。

慢性毒性:实验动物长期每日重复暴露于受试

物出现的有害作用。

原理

在动物的大部分生命期间，经过反复给予

受试物后观察其呈现的慢性毒性作用及其剂量一

反应关系，特别是进行性的不可逆毒性作用及肿

瘤疾患。并确定受试物的未观察到有害作用剂

量，作为最终评定受试物能否应用于保健食品的

依据。

实验动物

①动物种类的选择:原则上，宜选用接近人体代

谢特点的实验动物，因为当前已掌握大、小

鼠各品系的特点及诱发肿瘤的敏感性，可优先用

于慢性毒性和致癌试验；慢性毒性试验啮齿类动

物用大鼠，致癌试验大小鼠均可。对活性不明的

受试物，则宜用两种性别的啮齿类和非啮齿类动

物。

②动物起始周龄和体重:一般用雌、雄两种性别

的断乳大鼠或小鼠。动物个体体重的变动范围不

应超出各性别平均体重的20%o

③肿瘤自发率:实验动物的自然肿瘤发生率原则

是控制到越低越好，但试验结束评价时主