【黄瓜枯萎病生防细菌的筛选实验探究报告6700字（论文）】

黄瓜枯萎病生防细菌的筛选实验研究报告摘要近年来，由于生防菌防治枯萎病清洁高效，易于人工控制，并且相比于嫁接、施用农药等物理化学方法成本低，持效期长，因此，利用生物学方法防治黄瓜枯萎病逐渐走进人们的视野。本研究为了筛选出对黄瓜枯萎病具有防治效果的拮抗细菌，从黄瓜和辣椒根围土壤采样，并对样本进行细菌分离得到了183株细菌，其中42株具有产纤维素酶活性，16株具有产嗜铁素活性。通过平板拮抗实验发现，5株细菌具有抑制枯萎病生长的作用。在该5株拮抗细菌中，2株同时具有上述酶活性，2株均不具备上述酶活性，1株只具有产嗜铁素活性，且5株细菌拮抗病原菌活力大小与产酶活性之间无相关性。因此，针对特定病原菌，生防菌株的筛选还需要考虑更多可能存在的影响因素，以提高筛选效率。关键词：黄瓜枯萎病；拮抗细菌；纤维素酶；嗜铁素目录TOC\o"1-3"\h\u1绪论 12材料与方法 42-1材料 42.-1-1样品的来源 42-1-1培养基的配制 42-2菌种分离 42-2-1土壤样品处理 42-2-2菌种分离 42-3测定项目与方法 52-3-1酶活性的检测 52-3-2平板拮抗真菌活性筛选 53结果与分析 63-1嗜铁素和 63-2平板拮抗真菌活性 8参考文献 91绪论随着人口的快速增长，经济的不断发展，人们对于食品的需求也不断加大，对食材品质要求也是同样水涨船高。其中，黄瓜作为一种富含大量维生素，同时口感清脆，口味清爽的蔬菜，成为了经常出现在餐桌上的角色。我国耕地面积世界排名第三，目前全世界黄瓜总栽培面积达到146.67万hm2，其中我国栽培面积达到33.33万hm2以上，达到世界产量的五分之一，因此对于黄瓜种植也同时需要加大重视[1]。黄瓜的种植生产需要光照充足，空气流通的生长环境，如果操作不得当，导致空气不流通，湿度较大的话，很有可能会产生各种各样的病虫害。黄瓜苗期和成熟期会出现的病虫害比较多，大致可以分为以下四类：真菌性病害，细菌性病害，生理性病害以及病毒性病害[2]。其中枯萎病对于黄瓜种植生产威胁最大。黄瓜枯萎病，又称萎蔫病，蔓割病，死秧病，是一种典型的土壤传染，通过根部或者颈部进入黄瓜组织，寄生在维管束内大量繁殖，堵塞导管的系统性疾病[3]，其发病率一般为10-20%，严重的可达到50%以上。因为该病害由半知菌亚门镰孢属的尖孢镰刀菌引起，主要存在方式为寄生，所以黄瓜枯萎病属于真菌性疾病。尖孢镰刀菌并不只单单侵染黄瓜植株，它有五个常见的专化型：黄瓜、西瓜、甜瓜、丝瓜以及葫芦。其中，黄瓜专化型专门在成熟期和苗期侵染黄瓜植株[4,5]。随着栽培面积的不断扩大，尤其是现在很多栽培选择在大棚中进行，空气不流通，阳光不充足，加上潮湿闷热的环境，就给了枯萎病真菌良好的生长环境，导致枯萎病的发病率不断上升。如果黄瓜种植期间染上了枯萎病，同时又没有受到正确的处理的话，一般会造成20-30%的减产，如果染病情况严重，有可能会绝收[6]。因此探索出高效清洁同时又不会对黄瓜产量产生过于严重影响的防治措施便成为了黄瓜培养过程中重要环节[7]。对于防治黄瓜枯萎病，有各种各样的方案，总体可分为物理防治方法，化学防治方法以及生物防治方法三大类。其中，预防枯萎病而采取的物理治理方法并不多，常见的主要有轮作和嫁接两个方式。轮作，顾名思义，就是种完一轮黄瓜之后，再种植非瓜类作物，然后下一期再种植黄瓜，然后循环下去。因为不同的植物其生理性质结构一般不相同，不适用于枯萎病菌的寄生，这对于病原菌的生长繁殖可以起到很大程度的抑制作用[3]。另一种物理防治方法就是嫁接。一般会将南瓜作为砧木，以优良黄瓜品种作为接穗培养，不让黄瓜扎根于有病菌侵害的土壤，预防枯萎病的发生。以上两种防治方法中，用轮作方式来抑制枯萎病菌生长的做法一般发病率较低，但是操作成本较大，同时也会导致作物收成不稳定。然而用嫁接的方式抑制发病的方式可以杜绝黄瓜作物苗期感染枯萎病，但是因为黄瓜会产生不定根，如果栽培偏深而把接种处理在土壤中，或者整架落蔓时茎蔓着地接触土壤，往往因为嫁接处产生不定根扎入土壤中失去嫁接防病的意义[8]。所以物理防治存在着防治方式较单一，预防效果受影响因素较多，同时对于作物的经济效应也会产生很大影响的弊端。关于化学防治方法，大部分农田里还是通过施放农药来达到预防或者抑制枯萎病的目的。目前使用的农药有速克灵，农用链霉素[9]，多菌灵等。但是，因为这些农药杀菌剂，容易造成残留，而且长时间使用会使病原菌产生耐药性，造成防治效果逐渐降低，同时农药产生的残留会被人们吸收进入人体，造成各种疾病，并且由于枯萎病是土传疾病，如果大面积实行土壤药剂处理，操作难度太大，操作成本昂贵[10]，所以近年来，高效清洁的生物防治逐渐引起了人们的关注。生物防治，顾名思义，就是通过生物学的方法利用遗传育种或者基因工程相结合的技术培育出新的抗病品种，或者接种拮抗菌，来达到预防黄瓜枯萎病的目的[11,12]。生物防治目前主要有用到一下两种手段：1.诱导抗性；2.接种有益菌[13-15]。诱导抗性防治，就是利用被弱化的或者无致病性病原菌株接种到黄瓜幼苗上，诱导黄瓜对枯萎病菌产生抗性，从而培育出具有抗性的黄瓜品种[16]。该技术不仅可以应用于黄瓜生产，对于其他能够患上枯萎病的农作物，例如甘薯，西瓜，番茄等，都有防治效果。在日本的甘薯产区，利用诱导抗性防治枯萎病的田间防效已达到83%-90%。虽然培育出来的品种具有良好的抗病性，但是这种培育方式存在着培育周期过长，并且随着培育代数增加，防效还会逐渐下降的缺点。因此，现代生防技术更多的是使用接种有益菌的方式。当下用来接种的有益菌大致可以分为两种，细菌和真菌。真菌主要有木霉属真菌，非致病尖孢镰刀菌，从枝菌根真菌，淡紫拟青霉等[17]。其中木霉菌极易分离和培养，繁殖速度快，能迅速占领空间，竞争养分，对于多种病原真菌具有重寄生作用，同时又有很强的纤维素分解能力，对于枯萎病菌的抑制作用很强，被认为是极具价值的植病生防因子。但是木霉菌单独培养时定殖能力不强，生长繁殖易受环境影响，导致其防治效果稳定性不佳。非致病性尖孢镰刀菌的防治机理主要为通过与病原菌竞争生态位和营养物质的方式对致病菌株的直接拮抗作用和通过寄主作用的间接拮抗作用[18]。丛枝菌根真菌广泛分布于农田生态系统中，可以与大部分植物根系形成菌根，加强植物对土壤当中营养成分的吸收，从而促进植物生长繁殖。相比于真菌，细菌在植物病虫害的防治方面也具有十分突出的优点：1.细菌种类繁多，生长繁殖速度惊人；2.许多细菌存在于植物的根部和地上部分，与植物的生理状态相适宜；3.细菌大部分可以人工培养，容易控制，在生产操作中也较容易实现4.有些细菌在防治病害的同时还可以分泌有益因子增加作物的产量。其作用机理主要为与病原菌竞争生态位，竞争营养，产生抗菌因子等。由于黄瓜枯萎病病原菌为真菌，其细胞壁中含有纤维素，几丁质等物质，因此接种可分泌纤维素酶的细菌可通过与病原菌竞争纤维素等生存资源的方式达到防治黄瓜枯萎病的效果。可产生嗜铁素的细菌防治机理可以简述为：铁元素是微生物生长繁殖当中必不可少的一种元素，病原菌大部分本身并不能或者很少产生嗜铁素，只能通过寄生宿主，利用宿主的嗜铁素吸收土壤中的铁元素，用于自身的生长繁殖。而通过接种可以自身分泌嗜铁素的细菌，可以让细菌与病原菌竞争铁元素，因为病原菌本身不能或很少分泌嗜铁素，其产生的嗜铁素也会被有益菌所利用，而生防菌产生的的嗜铁素却不能被病原菌利用，从而病原菌因为缺少铁元素而无法生长繁殖[19]，由此达到防治病害的效果[15,20]。为了获得能够防治枯萎病菌的生防菌，需要用最优化的方式筛选出最稳定最合适细菌菌种[21]。目前筛选生防菌用到的主要手段是根据其代谢产物活性大小和与病原菌的拮抗作用强弱来筛选[22]。本次实验拟通过目的性菌株初分离，结合菌株产生嗜铁素活性和菌株的纤维素酶活性测定，以及对黄瓜枯萎病病原菌的平板拮抗活性，旨在筛选出能够防治黄瓜枯萎病的生防菌株。2材料与方法2材料2-1-1样品的来源土壤样品：2016年9月在淮安丁集镇的蔬菜大棚，随机分别选取5处黄瓜和辣椒的根围土壤，另外各取一份非根围土壤做对照。供试真菌：枯萎病原菌（Fusariumoxysporum）。2-1-2培养基的配制2-1-2-1LB培养基：琼脂15g，酵母浸粉5g，氯化钠10g，胰蛋白胨10g，定容至1000ml，pH7.2[4]。2-2-2-2KB培养基：蛋白胨20g，甘油10ml，硫酸镁1.5g，磷酸氢二钾1.5g，琼脂15g，定容至1000mL，pH7.2。2-2-2-3纤维素酶活性测定培养基：蛋白胨10g，羧甲基纤维素钠10g，酵母粉10g，磷酸二氢钾1g，琼脂18g，氯化钠5g，定容至1000mL，pH7.0。2-2-2-4WA培养基：蛋白胨5g，牛肉膏3g葡萄糖10g，氯化钠5g，琼脂20g，定容至1L，pH=6.8。2-2-2-5PDA培养基：马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂15~20克，定容至1000mL。2-2菌种分离2-2-1土壤样品处理将灭菌的LB和KB培养基均匀的倒在培养皿上，待其变冷凝固后，将土壤样品5g溶于45mL灭菌水中，摇匀后进行梯度稀释至10-5。分别吸取10-3，10-4，10-5三个梯度100µL涂布在已凝固的培养皿上，做了5组平行样品。做好标记放入28℃恒温培养箱内下培养2天。培养完成后将平板取出，数菌落数并记录。2-2-2菌种分离每种样品各选一个有足够合适菌群数的培养皿，用接种环从分离培养皿上蘸取菌种，以划线的方式将其划在相应的培养基培养皿上，每个培养皿可以接三个菌种，划线方式如下（图1）所示。将接好的平板做好标记在室温下培养2天，利用灭菌牙签挑取单菌落用液体培养基在28℃下扩大培养24h。培养后吸取菌液和80%灭菌甘油按照1:1体积混合，然后采用-70℃低温保存。通过初筛和复筛，最后筛选出183株细菌。图1菌株平板划线培养法2-3测定项目与方法2-3-1酶活性的检测2-3-1-1纤维素酶活性的检测：对筛选出的183株细菌参照GhoseT.K(1987)方法测定纤维素酶活性。把准备好的菌株用灭菌牙签接到纤维素酶活性测定玻璃板上(酵母粉10g，蛋白胨10g，羧甲基纤维素钠10g，氯化钠5g，琼脂18g，磷酸二氢钾1g，定容至1000mL，pH7.0)，30℃培养48h后，用1g/L的刚果红染1h后，倒掉染液，用1M的氯化钠浸泡1h。检测是否有透明圈。2-3-1-2嗜铁素活性检测：用筛选出的183株细菌，参照Shinetal等人(2001)的方法测定嗜铁素。A溶液：60.5mg铬天青S溶于50ml去离子水10ml三价铁溶液(1mML氯化铁3.6H2O，10mL盐酸为溶剂)和73mg十六烷基三甲基溴化铵溶于40ml去离子水溶液混合定容至100ml，pH调至中性，121℃灭菌20min。B溶液:900mlWA培养基，12g50%(W/V)的NaOH溶液将培养基pH调至6.8，121℃灭菌20min。A，B液混合倒平板，接菌，30℃培养3天进行观察。2-3-2平板拮抗真菌活性筛选将病原真菌Fusariumoxysporum，在potato-dextroseagar（PDA）培养基上培养。在28℃恒温培养一周后，菌落基本覆盖培养皿。用打孔器取下菌块，接种到LB培养皿上，将生长真菌的一面贴在容器的中间。使用灭菌的牙签将细菌接入进行拮抗培养，细菌分布在真菌块周围大约2厘米处，每各细菌间留有一定的距离，一个一个培养皿接7到8个细菌菌种。所有菌种都要做好标记，将培养皿放入恒温培养箱培养，注意培养皿必须倒置。3结果与分析3-1嗜铁素和纤维素酶活性由表1可以看出，能够产生嗜铁素的细菌绝大部分来自于能够在LB培养基上生存的细菌，只有一株细菌是可以在KB培养基上生存的；另外，10株是从辣椒根围土壤和中分离得到，另外6株细菌是从黄瓜根围土壤中分离得到。通过分析可知，由于KB培养基中所加入铁元素的含量很低甚至没有，所以通过分泌嗜铁素来吸收铁离子生长繁殖的细菌无法在KB培养基上生存，而LB培养基中因为加入了酵母浸粉，其中含有的微量元素给细菌提供了铁离子，于是需要铁离子来生长的细菌就可以正常存活，因此可分泌嗜铁素的细菌才会绝大部分都是由LB培养基培养的。另外，有学者研究得到[1,23]，由于黄瓜果实的生长过程中需要铁元素的参与，而相比之下辣椒的果实生长过程当中需要的铁元素含量远远低于黄瓜，因此大部分需要铁离子才能生长的细菌更容易在辣椒的根围土壤中生存，避免辣椒争夺铁离子，所以相比之下在黄瓜根围土壤当中生存的较少。表1嗜铁素活性筛选结果菌株编号菌株来源嗜铁素活性（水解圈半径）mm菌株编号菌株来源嗜铁素活性（水解圈半径）mmH2-12KH3-19LH3-1LH3-7LH3-8LHCK-8LL1-1LL1-3L黄瓜黄瓜黄瓜黄瓜黄瓜黄瓜辣椒辣椒2.62.0L2-3LL3-3LL4-4LL4-6LL4-8LL5-10LL5-2LL5-4L辣椒辣椒辣椒辣椒辣椒辣椒辣椒辣椒2.02.5表2表明，具有纤维素酶活性的42株细菌中，有31株细菌是来自于黄瓜根围土壤，只有11株是来自于辣椒根围土壤。另外，有26株都是在LB培养基上生长的，其余16株细菌是在KB培养基上生长。初步推测由于黄瓜生长过程中会产生很多的不定根以及藤蔓，这些藤蔓和不定根在黄瓜成熟时会随着果实一起掉落，因此很多可以分解纤维素的细菌会利用这些掉落的藤蔓，分解其中的纤维素作为自身生长的营养；而相比较下，辣椒根围土壤中的纤维素较少，所以其具有纤维素酶活性的细菌较少。表2纤维素酶活性筛选结果菌株编号菌株来源纤维素酶活性（水解圈半径）mm菌株编号菌株来源纤维素酶活性（水解圈半径）mm菌株编号菌株来源纤维素酶活性（水解圈半径）mmH1-11KH1-6KH2-22KH2-23KH2-25KH2-29KH2-3KH3-11KH3-12KH3-16KH3-1KL1-1KL3-1KL3-2K黄瓜黄瓜黄瓜黄瓜黄瓜黄瓜黄瓜黄瓜黄瓜黄瓜黄瓜辣椒辣椒辣椒4.81.02.01.01.03.02.55.0L3-3KL5-1KH1-13LH1-16LH1-17LH1-18LH2-17LH2-1LH2-2LH2-9LH3-10LH3-18LH4-12LH4-2L辣椒辣椒黄瓜黄瓜黄瓜黄瓜黄瓜黄瓜黄瓜黄瓜黄瓜黄瓜黄瓜黄瓜5.53.02.02.01.01.51.05.9H4-4LH4-9LHCK-14LHCK-15LHCK-16LHCK-17LHCK-18LHCK-1LL1-1LL1-2LL3-3LL4-5LL5-10LL5-3L黄瓜黄瓜黄瓜黄瓜黄瓜黄瓜黄瓜黄瓜辣椒辣椒辣椒辣椒辣椒辣椒6.92.03.52.02.04.02.52.03.03.58.0AB图2分离的细菌产纤维素酶和嗜铁素活性(A、纤维素酶；B、嗜铁素)3.2平板拮抗真菌活性表3平板拮抗真菌活性检测结果菌株标号F.oxysporum(抑菌圈半径)mm菌株产纤维素酶活性（水解圈半径）mm菌株产嗜铁素活性（水解圈半径）mmH4-7LL1-1LL1-3LL3-6LL5-10L4.03.03.06.04.0-6.5--3.5-5.03.0-2.0 图3分离的细菌对枯萎病菌的拮抗活性从表3可以看出，5种细菌中，2种细菌具有产纤维素酶的活性，3种细菌具有产嗜铁素的活性，且5种可拮抗病原菌的细菌都是从可在LB培养基生长的细菌当中筛选得到。因此可以推测，有上述2种活性的细菌具有拮抗病原菌生长的可能。并且根据对比可知，拮抗作用的大小与细菌的嗜铁素活性或纤维素酶活性并无相关性，只能看出只要存在这2种活性，就能一定程度上抑制病原菌的生长繁殖。表中还有2类细菌并不存在本实验中测定的2种活性，但是仍然对病原菌产生的拮抗作用，推测可能是由于细菌与病原菌在其他营养物质如碳源和氮源方面的竞争导致。3.3结论本实验分离得到183株根围细菌，其中42株具有产纤维素酶活性，16株具有产嗜铁素活性。通过平板拮抗实验发现，5株细菌具有抑制枯萎病生长的作用，在该5株拮抗细菌中，2株同时具有上述酶活性，2株均不具备上述酶活性，1株只具有产嗜铁素活性，且5株细菌拮抗病原菌活力大小与产酶活性之间无对应关系。因此，针对特定病原菌，生防菌株的筛选还需要考虑更多可能存在影响的因素，以提高筛选效率。参考文献[1] 何晓明,林毓娥,陈清华,等.不同类型黄瓜的营养成分分析及初步评价[J].广东农业科学,2002,(04):15-17.[2] 文切木·艾尔肯.黄瓜种植过程中的常见病害及防治方法[J].南方农业,2016,10(21):60-61.[3] 罗文辉,黄忠明,吴运华.黄瓜枯萎病的发生与防治[J].现代农业科技,2007,(19):92-93.[4] 王亚娟,张显,杜胜利.黄瓜枯萎病与抗性遗传育种进展[J].西北农业学报,2005,14(5):168-172.[5] 许田芬.西瓜病虫害的种类及生物学特性研究[D].苏州大学农业昆虫与害虫防治,2008.[6] 朱育菁,车建美,肖荣凤,等.尖孢镰刀菌的生长特性[J].中国农学通报,2007,23(8):373-376.[7] 周开胜.厌氧还原土壤灭菌法抑制西瓜专化型尖孢镰刀菌[J].江苏农业学报,2015,(5):1006-1011.[8] 张立宁.嫁接黄瓜枯萎病防治[J].农业知识（瓜果菜）,2009,(6):27.[9] 何润云.混合农药防治黄瓜枯萎病效果及稳定性试验[J].长江蔬菜,2012,(2):69-70.[10] 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