抗风湿中药制剂中非法添加多种化学成分的HPLC检测

PAGEPAGE6抗风湿中药制剂中非法添加多种化学成分的HPLC检测刘放1，唐靓2(1．浙江省医学科学院药物研究所，杭州310013；2．浙江省医学科学院保健食品研究所，杭州310013)摘要：目的应用反相高效液相色谱-紫外检测(RP-HPLC-UV)技术分析检测抗风湿中药制剂中可能存在的化学药品成分。方法采用的色谱柱分别为AgilentHCC18(250mm4.6mm，5m)；流动相为甲醇-1mLL－1醋酸水溶液(60：40)，流速：1mL·min－1，捡测波长240nm。结果4种解热镇痛类化学药物和2种糖皮质激素关键词：高效液相色谱法；紫外检测器；醋酸泼尼松；醋酸地塞米松；萘普生；双氯芬酸钠；吲哚美辛；布洛芬；中药制剂DeterminationofpharmaceuticalcomponentinthetraditionalChineseantirheumaticbyRP-HPLC-UVLIUFang1，TANGLiang2(1．InstituteofMateriaMedicaofZhejiangAcademyofMedicalSciences,Hangzhou,,310013，China；2．InstituteofHealthFoodofZhejiangAcademyofMedicalSciences,Hangzhou,,310013，China)Abstract：ObjectiveTodeterminepharmaceuticalcomponentinthetraditionalChineseantirheumaticbyreversedphasehighperformanceliquidchromatography(RP-HPLC)-UV-Detector．MethodsTheseparationwasperformedonAgilentHCC18(4.6mm250mm，5m)withdetectivewavelengthat240nm．Themixturesolutionofmethanoland1mLL－1aceticacid(60：40)wasusedasmobilephasewithflowrateof1.0mLmin－1．ResultsThe4kindsantipyreticanalgesiccategorychemicalsubstancesand2kindsglucocorticoidwereprovedtobeseparatedcompletelyundertheselectedchromatographyconditions．ConclusionThemethodissimpleandaccurate，andcanbeusedfordetectingantipyreticanalgesiccategorychemicalsubstancesandglucocorticoidaduheratedinthepreparationoftraditionalChinesemedicineandhealthfood.Keywords：HPLC；UVD；prednisoneacetate；dexamethasoneacetate；naproxen：diclofenacsodium；indomethacin；ibuprofen；traditiona1Chinesemedicines风湿性及类风湿性关节炎是一种常见病，多发病，是临床医学一大顽症；其病程长，难于根治，给患者带来终身痛苦。而抗风湿类中药多数显效慢，需长期服用。因此，社会上一些无良企业和不法分子在抗风湿类中药制剂中非法添加多种化学药物，由于用药人群和用药剂量难以得到有效控制，加上患者多在不知情下长期服用此类所谓的中成药，将产生不可预知的不良反应，给患者的健康和生命安全造成严重危害。由于抗风湿类中成药所占市场份额较大，更容易为不法厂商所利用和添加违禁药品。目前，抗风湿类中药非法添加的西药成分主要有两大类，一类为解热镇痛抗炎类药物，具有解热、镇痛、抗炎和抗风湿等作用，————————————————————————————基金项目：浙江省公益性技术应用研究计划项目(编号：2012C037045)主要有双氯芬酸钠、吡罗昔康、布洛芬等；另一类为糖皮质激素类药，有着抗炎、抗过敏、抗毒素、抗休克和抑制免疫反应等作用，主要有醋酸泼尼松、醋酸地塞米松等。这些药物若长期、大量服用大都有严重的不良反应，应在医师的指导下根据患者病情需要合理由于非甾体类抗炎药和糖皮质激素在治疗风湿、类风湿性关节炎等疾病时效果显著，因此成为对症中成药中非法添加化学药品的主要对象。近年来这类药物常被违法地不加标注性的添加到中成药制剂中以增强效果，这种现象已受到药学工作者的普遍关注，已成为药品检验研究的热点之一。目前，在中成药中数个或单类添加解热镇痛抗炎类药物或糖皮质激素药物的分析报道较多[1-2]，但多种不同类非法添加成分的同时检测报道较少[3-4]，故建立同时检测不同类非法添加成分的方法是十分必要的。本文针对治疗风湿和类风湿的中成药制剂中非甾体抗炎药和糖皮质激素类药的违规添加现象，建立了一种RP-HPLC-UVD快速分析方法，以对4个非甾体抗炎药和2个糖皮质激素类西药成分进行快速筛查、定性识别和准确定量。1仪器与试药1.1仪器Shimadzu高效液相色谱系统(包括LC-10AT泵，CTO-10ASvp柱温箱，SPD-10Avp检测器)；HypersilC18(250mm4.6mm，5m)色谱柱（大连依利特），HypersilC8(250mm4.6mm，5m)色谱柱（大连依利特），AgilentHCC18(250mm4.6mm，5m)色谱柱（安捷仑公司）；N-2000se色谱工作站（浙江大学智达信息技术研究所），SartoriusBP124S电子天平(感量：1.2试药对照品：醋酸泼尼松（批号100012-200706）、醋酸地塞米松（批号100122-200805）、萘普生（批号10198-200403）、吲哚美辛（批号100258-200904）、双氯芬酸钠（批号10334-200302）、布洛芬（批号100179-201105）对照品(中国药品生物制品检定所)。实验样品：17个厂家18批抗风湿制剂从市场购置。试剂：乙腈(色谱纯，MERCKLTD．)，甲醇（色谱纯，上海陆都化学试剂厂），甲醇（色谱纯，安徽时联特种溶剂股份有限公司），甲醇（分析纯，上海陆都化学试剂厂），冰醋酸（分析纯，杭州化学试剂厂），乙醚（分析纯，杭州化学试剂有限公司），水为纯化水（自制）。2方法与结果2.1对照品的紫外吸收光谱绘制精密称取醋酸泼尼松、醋酸地塞米松、萘普生、吲哚美辛、双氯芬酸钠和布洛芬适量，用甲醇制成每1mL约含10~20g的溶液，作为供试品溶液。以甲醇为参比，1cm比色杯，在波长200~400nm范围内进行扫描，结果醋酸泼尼松的max=239nm，萘普生的max=231nm、醋酸地塞米松的max=239nm、双氯芬酸钠的max=278nm、吲哚美辛的max=208nm、布洛芬的2.2色谱条件色谱柱：AgilentHCC18(250mm4.6mm，5m)色谱柱。流动相：甲醇-1mLL－1醋酸=60:40；流速：1.0mLmin－1；检测波长：240nm；柱温：30C；进样体积：10L。在此色谱条件下，被测组分2.3溶液的制备2.3.1对照品溶液的制备分别精密称取醋酸泼尼松、醋酸地塞米松、萘普生、双氯芬酸钠、吲哚美辛、布洛芬6种对照品各约10.0mg，分别置10mL棕色量瓶中，加甲醇使其溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1mL各含1精密量取上述对照品储备液各1mL，分置6只10mL棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成每1mL各含100g精密量取上述对照品储备液各1mL（其中量取萘普生对照品储备液0.5mL，布洛芬对照品储备液4mL），置10mL棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成每1mL含萘普生50g、醋酸泼尼松醋酸地塞米松、双氯芬酸钠、吲哚美辛各100g、布洛芬400g的混合对照品溶液。2.3.2供试品溶液的制备[1-2,5]样品若为片剂、丸剂，则取其研细；样品若为粉末，则直接取样；若样品为胶囊剂，则取内容物研细，并与剪碎的胶囊壳混合均匀；样品若为液体制剂，则直接取样；称取或量取上述样品适量(相当于药品的1次服用量)，置100mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定质量，超声(300W，40kHz)提取30min，放冷至室温，再用甲醇补足减失的质量，摇匀，用0.45m微孔滤膜滤过，弃去初滤液，取续滤液作为供试品溶液。样品若为贴膏剂，则取1片，剪成碎片后，置于50mL具塞锥形瓶中，加乙醚15mL，多次洗涤并超声，直至基质从衬布上脱落并溶解，取乙醚溶液置蒸发皿中，于水浴上蒸发至近干后，残渣用甲醇分次溶解和洗涤，合并甲醇液并全部转移至50mL棕色量瓶中，再用甲醇稀释置刻度，摇匀，用0.452.3.3阴性样品对照溶液的制备取按标准检验符合规定，不含上述解热镇痛类和糖皮质激素类化学药物的阴性样品1次服用量（6粒），将内容物研细，并与剪碎的胶囊壳混合均匀，按2.2.2项下的方法制备2.3.4阳性样品对照溶液的制备取按标准检验符合规定，不含上述解热镇痛类和糖皮质激素类化学药物的阴性样品的一次服用量（6粒），将内容物研细，并与剪碎的胶囊壳混合均匀，分别加入醋酸泼尼松、醋酸地塞米松、双氯芬酸钠和吲哚美辛各约2.5mg、萘普生约1.5mg、布洛芬约10.0mg，按2.2.2项下的方法制备阳2.4专属性实验分别精密量取上述单一对照品溶液、混合对照品溶液、供试品溶液、阴性样品对照溶液和阳性样品对照溶液各10L，分别注入液相色谱仪，在2.2色谱条件下，6种化学药品与中药制剂中各成分之间均达到基线分离(R1.5)。阳性样品对照溶液在与6种对照品色谱相应位置上出现一一对应的色谱峰，阴性样品对照溶液在与6种2.5标准曲线绘制取2.3.1项下的混合对照品溶液，按2.2色谱条件，进样量依次别为2.5，5.0，7.5，10.0，12.5，15.0和17.5L，记录色谱图，以进样体积（X）为横坐标，相应色谱峰峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，结果6种成分在线性范围内的进样体积（X）与峰面积（Y表16种化学药品的回归方程、线性范围、相关系数、检测限及定量限Tab.1Theregressionequationoflinearrangeof6kindsofchemicaldrugscorrelationdetectionlimitandthelimitofquantification编号化学药品回归方程线性范围/gmL－1相关系数检测限/ng定量限/ng1醋酸泼尼松Y=4697.48X－10145.9825.5~178.50.99928.628.62萘普生Y=6385.33X+8248.4512.0~84.00.99881.86.03醋酸地塞米松Y=3911.67X－7377.4625.0~175.00.998912.541.64双氯芬酸钠Y=2666.43X－7689.1225.0~175.00.999011.839.35吲哚美辛Y=6339.37X－12978.2925.0~175.00.999111.237.36布洛芬Y=1877.22X－3275.6292.0~644.00.998520.568.32.6回收率实验取上述阴性样品一次服用量（6粒），将内容物研细，并与剪碎的胶囊壳混合均匀，置具塞锥形瓶中，平行操作9份，按高、中、低质量浓度，3份为一组，分别加入一定量的上述对照品储备液，再按2.2.2项下方法制备供试品溶液。按2.1项下色谱条件，分别进样测定，并计算平均加样回收率。结果回收率分别为：醋酸泼尼松104.9％(RSD=2.3％，n=3)；萘普生104.9％(RSD=2.3％，n=3)；醋酸地塞米松100.9％(RSD=2.7％，n=3)；双氯芬酸钠106.0％(RSD=1.4％，n=3)；吲哚美辛103.6％(RSD=3.5％，n=3)；布洛芬101.4％(RSD=2.1％，n=3)。2.7日内和日间精密度实验取2.3.1项下的混合对照品溶液，按2.2色谱条件，连续进样5次，每次10L，结果6种化学药品峰面积的RSD为0.74%～1.57%(n=5)，相应色谱峰保留时间的RSD为0.59%～0.87%(n=5)；取上述混合对照品溶液，每天进样1次，每次10L，连续5d，结果6种化学药品峰面积的RSD为1.96%～2.66%(n=5)，相应色谱峰保留时间的RSD为0.92%～1.18%(n2.8重复性实验按2.3.4项下操作，平行制备6份阳性样品对照溶液，按2.2项下依法进行测定，结果6份阳性样品对照溶液中6种化学药品峰面积的RSD为0.29％~2.07％(n=6)，相应色谱峰保留时间的RSD为0.20%～0.41%(n=6)，2.9供试品溶液稳定性实验取2.3.4项下的阳性样品对照溶液，在室温下分别在0，2，4，6，8和12h进样，每次10L，结果6种化学药品峰面积的RSD为1.22%～2.07%(n=6)，相应色谱峰保留时间的RSD为1.23%～2.07%(n=6)。表明供试品溶液在室温下12h内，各成分色谱峰峰面积基本无变化，具有较好的稳定性。2.10最低检测限与最小定量限以信噪比(S/N)为3作为检出限(LOD)，信噪比(S/N)为10作为定量限(LOQ)，取2.3.1项下每1mL含100g的6种化学对照品储备液，用甲醇稀释至一定质量浓度2.11耐用性实验取2.3.1项下的混合对照品溶液，分别采用3种不同品牌的色谱柱：①HypersilC18(250mm×4.6mm，5m)色谱柱；②AgilentHCC18(250mm×4.6mm，5m)色谱柱；③HypersilC8(250mm×4.6mm，5m)；按2.2项下色谱条件进行实验，得到6种化学药品相应的系统适用性参数，见表2。结果显示：4种非甾体抗炎类和2种糖皮质激素类成分在上述3种不同品牌的色谱柱中均能够表26种化学药品在不同品牌色谱柱上的系统适用性参数Tab.2Theapplicabilityofsystemparametersindifferentcategoriesofchromatographiccolumnof6kindsofchemicaldrugs色谱柱类型系统适用性参数醋酸泼尼松萘普生醋酸地塞米松双氯芬酸钠吲哚美辛布洛芬HypersilC18理论板数/n7587.32110848.4579527.44914696.29413688.29116062.351分离度/R14.8186.5742.16017.1311.6443.810托尾因子/T1.1261.0551.0460.9910.9931.025AgilentHCC18理论板数/n10107.78513500.83311791.48616397.8415514.97117322.002分离度/R18.6617.3293.28218.0133.1331.991托尾因子/T1.0991.0631.0791.0190.9921.087HypersilC8理论板数/n7699.1009818.5388963.61711842.15613262.91614624.189分离度/R13.2655.5681.84014.1582.4505.186托尾因子/T1.0751.0180.9280.9580.9350.9632.12样品分析取上述混合对照品溶液及17批批治疗风湿性关节炎的中药制剂，按2.3.2项下操作制备供试品溶液，按2.2色谱条件，依法测定，结果有3批为可疑样品，其色谱图中具有与醋酸泼尼松对照品溶液色谱保留时间相近的色谱峰，后经LC-MS/MS确认后，为阴性样品予以排除；其余14批治疗风湿性关节炎的中药制剂均未检出上述6种化学药品成分。3讨论3.1色谱条件的选择3.1.1检测波长的选择根据2.1项下对照品的紫外吸收光谱的结果，以上多数化学药品在240nrn左右有最大吸收，本文在220~280nm波长范围内对上述化学药品的检测波长进行了选择。为兼顾响应较低的药物(双氯芬酸钠和布洛芬)的检测灵敏度和基线平稳，并参考有关文献[1，6-9]，实验选择240nm作为分析3.1.2流动相的选择3.1.2.1流动相组成根据文献报道，中成药中非法添加非甾体抗炎药或糖皮质激素的检测，采用的流动相主要有乙腈-水[1，7-9]、甲醇-醋酸[10-11]、乙腈-醋酸铵[2-12]、甲醇-水-冰醋酸[13-14]等，经过比较，最后经综合考虑各化合物的峰形及分离度等因素，确定甲醇-1mLL-1醋酸（60:40）为流动相。中药成分一般为极性物质，保留时间较小，在本文的色谱系统中，中药制剂中辅料及其它成分的色谱峰的保留时间大多在10min以前，因此，对所分析的非甾体抗炎药和糖皮质激素的检出干扰不大；而6种化学成分保留时间均大于10min，能与中药制剂中辅料及其它成分完全分离。3.1.2.2醋酸含量实验考察了用1，2和4mLL－1的醋酸溶液对色谱分离的影响，结果3种醋酸含量对色谱峰的分离度、峰形及峰面积基本一致，均能取得满意的分离效果。出于对仪器及色谱柱的保护，综合考虑各方面因素，选用酸性最小的1mLL－13.1.2.3流速实验考察了0.8，1.0和1.2mLmin－13个流速对色谱分离的影响，结果当流速为0.8mLmin－1时，各成分的保留时间延长，尤其是保留时间30min色谱峰变宽，峰形变差；当流速分别为1.0和1.2mLmin－1时，各成分的保留时间适中，色谱峰的峰形良好，峰面积之间差别不大；但流速为1.2mLmin－1时，柱压升高明显，且相同时间内流动相用量增加，分析成本加大；综合考虑各个因素，实验选用色谱分析中较为常用的流速：1.0mLmin－13.2制样方法的选择3.2.1提取溶剂的选择一般甲醇对中药制剂中的成分的提取效率较高，参考中国药典[6]中被测各化合物的化学结构和溶解性能，经综合考虑确3.2.2提取方法的选择实验选用一般中药制剂含量分析中较为常用的超声提取方法，并对超声提取时间进行比较(20、30和40min)，结果超声提取30min，即可提取完全。样品若为贴膏剂，提取方法则选用文献的方法3.3分析对象（化学药品）的选择本文选择的6种化学药品包括4种非甾体类抗炎药(萘普生、双氯芬酸钠、吲哚美辛和布洛芬)、2种糖皮质激素(醋酸泼尼松和醋酸地塞米松)，它们都与抗风湿类中成药作用相似、且这些原料成本相对偏低，价格便宜、容易被不法厂商非法添加到该类中成药中；本文将6种化学药品采用同一方法检测，能够使此类中成药中掺伪的检出更加快速和方便。3.4实验应避光操作由于本实验所检测的6种组分中，大部分对光不稳定，所以在实验过程中，应注意避光操作。4小结中药制剂及保健品中通常含有多种成分，为达到最好的分析结果，需选择合适的提取溶剂、提取方法和优化液相色谱的分离条件。在本文的选定的色谱条件下，中药制剂中的辅料及其它成分的色谱峰的保留时间大多在10min以前，而各6种被测化学成分的出峰时间均在10min以后，故中药制剂中的辅料及其它成分对所分析的非甾体抗炎药（4种）和糖皮质激素（2种）的检出干扰不大。本法是一种快速筛查方法，一次提取和进样可完成多种成分的定性，适用于怀疑掺有上述6种抗风湿化学药品的中药制剂的快速筛查，方法的专属性较强。由于化学药品添加的量一般都很大，因此掺伪的色谱峰容易识别。但因抗风湿类中药制剂通常含有多味中药，每种药材中均含有多种组分，而紫外检测器选择性不强，光谱特征性不够，仅采用色谱保留时间和紫外光谱鉴别易得出错误的结论。总之，HPLC法适用于对可疑样品进行初筛，而准确对中药制剂中非法添加化学成分的鉴定还需要采用液-质联用仪进行确证。参考文献：[1]吴小红，李焕德．高效液相色谱法-二极管阵列检测器同时分析测定中成药及保健品中非法添加的9种糖皮质激素[J]．中南药