分子生物学学习资料：分子生物学阅读延伸译文

1.研究相互作用蛋白质组学的意义?

蛋白质很少单独发挥其功能，通常都是多种蛋白质形成复合物起生物学作用，全球范围内蛋

白质-蛋白质相互作用的研究，也就是所谓的相互作用组学已经成为非常重要的现代分子生

物学。蛋白质是所有细胞的重要组成部分，大多数细胞行使功能时蛋白质之间的相互作用是

必不可少的。如基因转录，细胞周期调控，信号转导或监控过程中等的基本过程都依赖于正

确的功能蛋白质复合物。“后基因组”时代的重要里程碑之一是功能注释的基因组数据的积

累。蛋白质形成时的干扰或对组织内蛋白质复合物的干扰，往往会导致细胞功能障碍，最终

导致疾病。而且，在不同的组织和细胞中,蛋白质复合物的组成并非一成不变，为适应细胞生长

的微环境变化，蛋白质复合物的各组成成分还存在着时间和空间的表达差异性。因此,在组织

或细胞中众多蛋白质协同发挥生理作用的过程中，蛋白质复合物的组成分析尤其重要，这也

进一步要求我们充分揭示一个细胞或组织中完整的蛋白质-蛋白质相互作用网络一蛋白质相

互作用组。

2.相互作用蛋白质组学的研究方法有哪些？

答：⑴生物化学方法：①免疫共沉淀法；②亲和层析法。⑵遗传学方法：①yeasttwo-hybrid;

(2)Protein-fragmentcomplementationassay(PCA);(3)Membraneyeasttwo-hybrid(MYTH);@

Resonance-energytransfer(RET)systems包括FRET、BRET、BRET-FRET(SRET)>TR-FRET和FRAP;

⑤luminescence-basedmammalianinteractomemapping(LUMIER);⑥Themammalian

protein-proteininteractiontrap(MAPPIT)anditsvariants(ArrayMAPPIT、MASPIT和Reverse

MAPPIT);⑦Phagedisplay;⑧Proteinmicroarrays。

①酵母双杂交②蛋白质的片段互补分析(PCA);③膜酵母双杂交(MYTH):④共振的能量转

移(RET)系统包括FRET,BRET,BRET,荧光共振能量转移(SRET),TR-FRET和FRAP;⑤基

于发光的哺乳动物相互作用组的映射(LUMIER)；⑥哺乳动物的蛋白质-蛋白质相互作用的

陷阱(MAPPIT)及其变种(的阵列MAPPIT,MASPIT和反向MAPPIT);⑦噬菌体显示屏;⑧蛋

白质微阵列。

3.与传统蛋白质相互作用研究方法相比，相互作用蛋白质组学的优势在哪里？

答：相互作用蛋白组学技术可以在生理条件下获得与靶蛋白相互作用的蛋白质，候选蛋白质

与靶蛋白的结合机会均等；灵敏度高；鉴定出在空间上非直接物理相互作用的蛋白质，避免

假阳性出现;检测多亚基蛋白质之间的相互作用；能适用于大规模蛋白质相互作用的研究等。

传统方法由于其粗糙性和经济承受能力HTP互动目前可用的数据仍然是基于经典的Y2H。虽

然它最近已表明，V2H网络提供高品质的二进制交互信息，但该方法具有的固有的局限性,

如收缩相互作用的核和使用酵母作为宿主系统。而现在的方法是以酵母系统为基础，应用哺

乳动物系统，因此提供了一些优势，并且，他们往往是技术上的挑战，而不是扩展到HTP

格式。如的PCA,RET为基础的方法或MAPPIT操作方法在哺乳动物细胞中，它可以补充耦

合质谱方法（AP-MS）。这是经常选用的方法，因此HTPPPIs类药物的研究被广泛使用的亲

和纯化。虽然AP-MS需要相对严格的生化隔离的蛋白质复合物，但它可以适用于宽范围的

细胞类型。随着相互作用蛋白质组学的成熟可以有更多新颖的发现，也可以使我们更好的了

解细胞内蛋白质之间的相互作用。

1.基因芯片在医学中有何应用？

（1）发现新基因（2）基因表达分析（3）DNA序列测定与序列间比较（4）突变体和多态

性的检测（5）疾病的诊断。（6）药物研究的重要技术平台，大量应用与耐药性检测、药物

靶点寻找、高通量的药物筛选、药物作用机制和毒理研究等。

2.基因芯片的使用应注意哪些问题？

①根据研究课题的需要来选取相关基因芯片。

②基因芯片的数量：每实验组应最少有5~6块基因芯片才具有统计学意义。

③利用基因芯片时必须了解在什么时间取材和取什么组织进行检测的问题。在什么时间取材

需要研究者根据相关文献和实验目的而定。取材时应注意不要将无关组织带入实验材料中，

以免影响取材的准确性。

④组织的取材量由组织类型和基因芯片的一次成功率决定。

⑤不能单凭基因芯片检测结果而对不同表达的基因之间的关系做出结论。

⑥随着蛋白芯片技术的发展，将基因芯片技术与蛋白芯片技术结合使用，可提高实验结果的

可靠性和准确性。

⑦可采用与基因芯片公司合作的方式进行，在合作中，应就实验的设计等问题与基因芯片公

司协商。避免由于实验设计等原因导致实验的失败。同时，应与基因芯片公司签订有关合同，

明确双方的义务和责任。

3.基因芯片有哪些优点和缺点？

优点：检测效果：准确、可靠、灵敏。检测方法由由荧光扫描仪检测，计算机自动分析，方

便、快捷。成本低。与传统诊断区别：直接以病理基因（致病基因、疾病相关基因和外源性

病原生物基因等）为分析对象。可以一次性对样品大量序列进行检测和分析。

缺点：技术成本昂贵、复杂、检测灵敏度较低、重复性差、分析泛围较狭窄等。

中枢神经系统(CNS)结核，特别是结核性脑膜炎(TBM)是结核分枝杆菌(M.Tb)感染最为严重的

形式，尽管近期在抗结核治疗方面取得了一定进展，但是在感染的患者中一半以上会出现死

亡或严重的中枢缺陷。CNS结核的决定性诊断取决于脑脊液(CSF)中M.Tb的检测。现在

CNS结核的诊断依然是个难题，因为在TBM急性阶段广泛应用的细菌学检测方法的“金标

准”(如直接涂片和细菌培养)在检测CSF标本中的M.Tb时敏感性并不高。与传统的“金标

准”不同，最近多种分子学方法包括核酸扩增(NAA)分析技术，特别是聚合酶链式反应(PCR)

分析法，已经作为一个诊断CNS结核的新兴方法浮现。因其有快速、敏感和特异的特点。

此外，巢式PCR分析技术的革新值得关注，因为他能改进CNS结核的诊断。本文中，对最

近的NAA方法，主要是PCR技术作一概述。

1、简介

在美国，由M.Tb引发的CNS疾病特别是结核性脑膜炎(TBM)并不常见，占所有结核病例的

1%左右。中枢神经系统(CNS)结核是结核分枝杆菌(M.Tb)感染最为严重的形式，尽管近期在

抗结核治疗(ATT)方面取得了一定进展，但是在感染的患者中一半以上会出现死亡或严重

的中枢缺陷。止匕外，由于广泛传播的AIDS引起越来越多的免疫功能不全的的群体、逐渐增

加的老龄化人群、免疫抑制剂的广泛应用等原因，使得TBM成为一个严重的临床和社会问

题。因为CNS结核相对稀少且引起的中枢症状无特异性，所以其诊断有很大难度。对于TBM

来说，针对结核进行准确快速诊断和早期治疗尤为重要，否则会导致预后不良和长期的神经

方面的后遗症。然而，M.Tb传统的基于细菌学的金标准检测法包括直接涂片进行抗酸染色

(AFB)和细菌培养不能对其进行早期诊断，因为敏感性较低且培养时间过长(4-8周)。

最近，用各种分子学方法，包括NAA分析技术，特别是PCR分析方法用于检测CSF中

M.TbDNA已经作为一个诊断CNS结核的新兴方法浮现。因其有快速、敏感和特异的特点。

许多学者认为虽然不同的实验室和每种类型的检测方法之间的PCR敏感性有着显著差异(65

-83%),但是不能用PCR法检测CSF中的M.TbDNA。而且，有报道将巢式PCR法作为检测

CSF中M.TbDNA的强效方法。与传统的单级PCR相比，这种新方法可显著增强DNA扩增的

敏感性和特异性。然而，由于其步骤繁琐耗时且有较高的交叉污染的风险，所以用巢式PCR

检测CSF以诊断TBM还有待于改进。目前，常规诊断实验室检测用实时PCR法。除了进行

常规的定性分析，实时PCR以其高度复制性使精确定量分析成为可能。

本文作者聚焦与NAA分析技术特别是PCR法的最新进展，并对期刊中和临床上关于

CNS结核诊断的演进作一概述。

2、结核的全球流行病学负担

2007年，据世界卫生组织(WHO)统计每年会有9.27百万活性结核新增病例，这导致每年约

1.6百万人死亡。结核依然是一个世界性负担，在不发达国家和发展中国家有大量新增病例。

实际上，在结核发病率上印度、中国、印度尼西亚、尼日利亚和南非依次位列第一到第五位。

在80%的新增病例中，像贫困、过度拥挤、营养不良和免疫系统功能不良等社会和人口统计

学因素在其世界范围内流行起重要作用，而余下的20%结核患者与撒哈拉以南非洲中的HIV

有关。在2007年新增的9.27百万病例中，约有1.37百万（14.8%）HIV阳性。

CNS感染是结核最为严重的感染形式之一。在美国针对肺外结核进行的大范围流行病学研究

中CNS相关的病例占总肺外结核的5-10%,与2010年CDC新进估计的5.5%（CVS结核占总

结核病例的1.2%）相近。在CNS结核最大的前瞻性流行病学研究中，从加拿大收集的

1970-2001年间82764个结核病例中，CNS结核的发病率接近L0%。然而，尽管在像美国这

样的发达国家中结核病例的总数量在减少，但是，有报道表明肺外结核所占比例在渐进式增

加。造成这一现象的原因在于近年来免疫功能不全患者的增加和HIV/AIDS流行率的盛行。

此外,尽管结核的基于人口的总死亡率较低且正在减少，但是已有研究显示伴有肺外结核（包

括CNS结核、TBM和传播性疾病）患者的死亡率会显著增加

现已确认几个引发CNS结核的风险因素。年龄（儿童〉成人）和合并HIV感染的患者均属患

CNS的高风险因素。其他危险因素包括营养不良、近期小儿麻疹、酗酒、肿瘤成人免疫抑制

剂的应用和社区流行的疾病。发达国家中有研究表明在CNS患者中，外国出生的个体（即

出生于发达国家以外国家的人）呈现出更高的患病率。

3、CNS结核的现行诊断方法

现在，CNS结核诊断依然是一复杂问题，因为像直接涂片抗酸染色和M.Tb培养等广为应用

的传统的细菌学检测方法不能快速检测出CSF标本中的M.Tb,因其在TBM急性阶段敏感性

较差。考虑到CNS结核的预后和长期神经后遗症，其急性阶段的快速准确诊断和早起开始

ATT治疗显得尤为重要。基于微生物技术进行的传统的“金标准”在诊断TBM时敏感性较

差且不能及时得到结果，而临床要求诊断方法要更为敏感、快速、精确。现已有应用于结核

病呼吸道标本的检测技术，从这些技术中抽出几个基于分子的方法对CNS结核进行诊断，

这种做法是否合适仍处于评估阶段。这些技术包括商品化的NAA法和其他PCR类方法。此

外，像磁共振成像（MRI）等神经放射成像技术的应用显著提升TBM和结核诊断的准确性。

最近，有大量应用神经放射成像技术评估CNS结核的报道。公认的TBM神经放射方法用于

基础脑膜强化、脑积水和幕上脑实质和脑干梗塞的诊断。而且，通常认为脑内结核瘤强度有

高有低。伴有不规则壁的圆形或分叶状肿物，并且调节对比度后呈均质或环状增强。然而,

当只用神经放射成像技术时，无法区分结核瘤和其他想像真菌颗粒这样的脑内集聚性损伤。

因此，我们认为是基于分子学的技术和神经放射成像结合的方法是有发展前景的方法，在诊

断TBM和结核性肿瘤中非常好，而不是伴或不伴有经典的细菌生物学技术的神经放射成像

技术。

肺结核的研究和治疗

4、PCR技术的最新进展

诊断M.Tb的NAA法是通过对来自痰液或CSF等临床标本进行M.Tb的DNA或RNA提取和扩

增，以检测是否含有结合杆菌。PCR技术是典型的DNA扩增方法。鉴于PCR分析技术的最

新成就和进展，在这部分，我们对其原理做一概括。

4.1PCR的基本原理

图1简要阐释了PCR的基本原理。从根本上说，PCR分析技术依赖与热循环，包括重复加热

和冷却以使DNA变性及其酶的复制。短的DNA片段称为引物，他有与含DNA酶的靶区互补

的序列，是使特异性DNA序列扩增的重要组成部分。热循环的第一步是在高温（94-98℃

20-30秒）下进行双链DNA的物理分离。这被称为DNA变性阶段。在较低温度（50-65/20-40

秒）下，将与靶DNA互补的引物退火到每一个单链DNA模版上，该步为退火阶段。PCR的特

异性主要来源于与模版序列完全匹配的引物序列和取决于于引物长度的退火温度。DNA多

聚酶连接到引物-模版杂交链上开始DNA复制。DNA聚合酶从5'到3'方向组装合成一条

新的与DNA模版互补的链，该步叫延伸。一般来说，几乎所有的PCR均需要耐热的DNA聚

合酶，如最初从嗜热水生菌中分离出的Tap聚合酶。结果，它实现了连续重复热循环程序,

即交替的加热和冷却步骤。进行热循环时，合成的DNA片段自身作为模版进行复制，成为

一个连续的链式反应，使得DNA模版成倍的扩增。

用琼脂糖凝胶电泳的方法根据扩增的DNA片段长度（分子量）的不同将其分离。然后用含

EB（澳化乙定）的溶液处理，EB是在琼脂糖凝胶电泳中使DNA条带可见的最常用的染料。

因为在UV灯下EB荧光嵌入DNA主要的槽中，经EB处理后，可见明显的扩增的靶DNA片

段的条带，进而进行检测。

4.2、巢式PCR法原理

图1b为巢式PCR法的基本原理。巢式PCR法是改进的PCR法,旨在显著增强扩增效率、减

少因非目标引物结合位点扩增引起的非特异性PCR产物。尽管普通PCR特异性取决于与靶

DNA序列结合的引物的互补性，但引物常与其他相似的DNA区域结合,产生像引物二聚体、

发夹结构和替代性目标序列这样的不相关的PCR产物。巢式PCR使用两对引物，应用于PCR

的两个连续性步骤中。特别是，第二对引物在首步PCR产物中进行再次扩增；这就是“巢

式”这一概念的来源。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。然而，第二对引物结合

在第一次PCR产物内部进行第二步PCR产物扩增，第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。

巢式PCR的优点在于如果第一步扩增了不相关或非特异性片段，第二次能在错误片段上进

行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR是一项非常好的技术，他可通过两步扩增

获得足量的靶DNA,并且他可通过降低非特异性产物的扩增显著改进靶序列的特异性。

4.3、实时定量PCR法原理

实时定量PCR法是一种变异的PCR技术，旨在扩增并且同时定量靶DNA分子；他可进行检

测和定量。尽管实时定量PCR法的基本步骤衍生于普通的PCR法，但是其重要特点在于可

在反应过程中实时检测扩增的DNA片段。与传统的普通PCR（在反应的终末阶段检测PCR

产物）相比，这是一新的革命性的方法.实时检测PCR的两种常用方法如下：（1）用像SYBR

Green这样的非特异性荧光染料嵌入任意双连DNA中（2）用像TapMan探针一样的序列特

异的寡聚核甘酸探针标记荧光报告染料，只有该探针与互补的靶序列杂交后才能被检测到。

前者（SYBRGreen）结合包括非特异性PCR产物（如引物二聚体）在内的所有双链DNAPCR

产物。这是其潜在的缺陷，因为他会影响预期目标DNA的精确定量。

相比之下，像TapMan探针这样的荧光报告探针只检测包含互补探针序列的DNA片段；因

此，即使出现非特异性的扩增片段，应用这类报告探针依然可以显著增强特异性并且能精确

定量。图1C所示为基于荧光探针技术（TaqManPCR）的实时定量PCR的基本原理。用荧光报

告染料(如FAM或VIC)在5'端标记序列特异性寡聚核甘酸探针，在3'端标记共朝的淬

灭染料(如TAMRA)。荧光报告染料和淬灭染料非常接近，阻止荧光的发散。当反应被启动

时，在PCR退火阶段，探针和引物均与靶DNA序列退火。当PCR反应继续时，Taq聚合酶

的5'-3,核酸外切酶活性使探针分解，进而使报告集团和淬灭集团分离，导致报告染料的

非淬灭集团放射荧光，该荧光可在激光激发后得到检测。因为荧光报告染料与淬灭染料的分

离方式与PCR循环过程有关，所以荧光强度呈指数形式增加。这种增加被用来测定Ct值，

以计算每一次反应的扩增率。最终可以精确测量主量DNA

最新的中枢神经系统结核的PCR诊断

5、检测M.Tb的商品化NAA法

如今，美国食品药品管理局(FDA)己通过了两中可行的商品化NAA法，用于M.Tb的直接

检测。如下：罗氏Amplicor结核分枝杆菌测试(RocheDiagnosticSystems,Inc.,Indianapolis,IN,

USA)和基因探针扩增结核分枝杆菌直接(MTD)检测(Gene-Probe,Inc.,SanDiego,CA,USA)两种

检测均用M.Tb(GenBankaccessionno.NC000962.2(1471846-1473382))的16S核糖体

RNA(rRNA)作为扩增的靶序列。16s核糖体RNA(rRNA)代表着微生物的稳定属性，被广泛应用

于确定分枝杆菌种类。

罗氏Amplicor检测应用的是普通PCR法。在这种检测试剂盒中用引物对和M.Tb特异性的16S

核糖体RNA(rRNA)进行扩增和检测。此外，罗氏CobasTaqManMTB检测是Amplicor检测的

改进方法，它采用的是实时(TaqMan)PCR技术。同时，基因探针扩增结核分枝杆菌直接(MTD)

检测是等温的RNA扩增方法。在这种检测试剂盒中，在恒温(43。。条件下通过反转录酶和

RNA聚合酶耦合，使M.Tb的16S核糖体RNA(rRNA)直接扩增，用特异性oligo-RNA探针杂交

方法进行检测。现在,FDA规定Amplicor法只能用于痰涂片阳性的呼吸道标本的检测。同时，

不管AFB的痰涂片结果如何，均可应用MTD法检测呼吸道标本。有几项研究报道，在AFB

痰涂片阳性标本中，两种检测方法均可获得满意的结果(敏感性和特异性均高于95%),但

是,应用于AFB痰涂片阴性标本时，敏感性降低(60-85%)。FDA规定，两种方法均不能应用

于CSF的检测。

6、PCR技术的临床应用：CNS结核的诊断

表1总结了用PCR技术诊断CNS结核的效果。应用NAA技术的难点在于CSF标本中M.Tb

的快速诊断，CSF标本多数来自主要出现在TBM中的少数杆菌，还有CSF中扩增抑制因子的

出现。在临床实际实践中，诊断CNS结核时，PCR的敏感性和特异性是最为重要的。为改进

PCR法的敏感性和特异性，在CSF标本里从少数M.Tb杆菌中有效提取纯化DNA和设置特意

有效的模版引物以扩增M.TbDNA是最为重要的因素。因此，许多研究人员在这些问题上进

行着紧锣密鼓地工作。在20世纪90年代，Shankar、Kaneko、Lin等人报道许多从CSF标本

提取和纯化M.TbDNA的改进方法。据这些研究表明，用包含蛋白激酶K和十二烷基磺酸钠

(SDS)的细胞溶解液作为表面活性剂处理CSF标本，然后从处理后的CSF标本中用氛-氯抽

提法和乙醇沉淀法提取和纯化M.TbDNA。为更有效的从CSF样本中提取出少量的M.TbDNA,

作者用了高分子量载体Ethachinmate(NipponGenejokyo,Japan)和之前报道的氛氯抽提法和

乙醇共沉底法一起作为提取核酸的共沉底剂。然而，在最近的研究中发现，在临床实验中，

不适合用传统的氛氯抽提法和乙醇沉底法，因为这些方法步骤繁琐且非常耗时。通常情况下，

商用柱提取试剂盒（如QIAmp血包和QIAmpDNAMiniKit,（QiagenInc.,Valencia,CA,USA）,

CobasAmplicor呼吸道标本制备试剂盒（RocheDiagnosticSystems,Inc.,Indianapolis,IN,USA））

己经在之前的研究中被广泛用来从各种样本中提取DNA。然而，在现行的研究中，商用柱

提取试剂盒不能从CSF标本中提取出M.TbDNA；因此，这些广为应用的试剂盒不适宜用来

提取CSF标本中小量的M.TbDNAo

当前，用NAA法评估了四种主要的M.TbDNA特异性序列（即IS6110区插入序列（Rv3475:

GenBankaccessionno.NC000962.2（3891051-3892091））,65-kDa热休克蛋白抗原（Rv0251c:

NC000962.2（302173-302652））,16SrRNA基因和MPT64（NC000962.2（2223343-2224029））。

在这四种序列区域中，IS6no区插入序列是一个专门在M.Tb复合物基因组中发现的重复性

元件，在许多研究中，他已广泛用于有优越扩增效率的靶序列（表1）。在这些之前的研究中，

针对IS6110插入序列的PCR检测用于TBM诊断是显示比较好的效果（总的敏感性为70-98%,

特异性为80-100%）（表1）。此外，靠近IS6110插入序列，16SrRNA基因常用于NAA检测,

并且他是两个商用M.Tb检测方法（即RocheAmplicor检测和基因探针MTD检测）的靶序列。

如前所述，这两种方法检测呼吸道标本已经得到FDA认证。现在尚无得到认证的用于CSF

检测的商用NAA方法，但是有研究评价了他们在TBM病例中的效果（表1）。最近一项关于

商用NAA法诊断TBM的荟萃分析显示总体的敏感性为56%,特异性为98%。基于这些研究

结果，人们认为商用NAA法可能在诊断TBM中起一定作用，但因其敏感性较低，所以不是

确诊TBM的理想方法。因为不能用这两种商用NAA法诊断TBM的主要原因在于其敏感性

较差，所以可以认为，他们可以用于检测包含大量M.Tb杆菌的呼吸道标本，但不能用于检

测CSF样本中的少量M.TbDNA。近来有研究表明，改进的基因探针MTD检测可提升CSF中

M.TbDNA的检测效果。然而，这些改进技术的应用仅限于单个的实验室，尚未得到广泛应

用。同时，MPT64是编码MPT64蛋白的基因序列，这在M.Tb复合物中有特异性，且仅存在

于M.Tb基因组中的一个位点上，因此，认为MPT64是PCR法中最具特异性的序列，已经在

许多研究中用作PCR的靶序列。Lee等人比较了IS6110,65kDa抗原和MPT64三个序列，认

为MPT64是PCRM.TbDNA扩增中最具特异性和敏感性的序列。

除了商用NAA法，应用PCR法扩增M.TbDNA己经得到了许多临床上的关注（表1）。

正如上面所描述的一样，为了改进诊断CNS结核的PCR法，科研人员已经尝试了各种想法。

最近，发明了革命性的巢式PCR技术以诊断CNS结核，与传统的PCR相比，他能显著增加

敏感性和特异性。Liu等人报道，针对MPT64序列的巢式PCR被用于CSF标本的检测，这些

标本来自临床怀疑感染TBM的21个患者，巢式PCR使得24小时内TBM诊断的敏感性为

90%,特异性为100%。此外，他们报道说，巢式PCR的敏感性比普通的PCR高1000倍。作

者从临床收集了9个高度怀疑TBM患者的CSF标本用巢式PCR法检测了MPT64序列。在我

们的研究中，巢式PCR的敏感性和特异性均为100%,但是普通PCR和M.Tb培养的敏感性

仅为22.2%。而且，我们检测了巢式PCR的最低检测敏感性。巢式PCR的检测水平在1-10

复制份数/2UL纯化的M.TbDNA,与传统的PCR相比，其敏感性从1000倍提升到10000倍。

考虑到PCR分析结果和ATT反应之间的关系，Lin等人用普通PCR.Scarpellini等人用巢式PCR

分别检测了这种关系。值得一提的是，Scarpellini等人进行了历时性研究，他们从接受临床

治疗的7名患者中收集了一些CSF标本，用巢式PCR测定了IS6110序列。在他们的研究中，

巢式PCR结果显示4个TBM患者在ATT过程中的临床状况转阴。与此相反，没有ATT反应

的3位患者整个临床过程中的巢式PCR结果依然为阳性，最终死亡。因此，Scarpellini等人

认为巢式PCR可用于评估TBM的临床治疗过程。与此相似的是，在我们的研究中，从7个

高度疑似TBM的患者收集ATT治疗中的27份CSF标本，用巢式PCR法进行检测，其中有

11份（40.7%）显示阳性。而且，我们的巢式PCR结果显示，在ATT中6位患者的临床状况得

到改善，结果转阴。与此相反，从7位接受临床治疗的患者中收集27份连续标本，用传统

的PCR和M.Tb培养法检测，结果显示为阴性。巢式PCR有着优异的敏感度和特异性，是一

种实用的方法。有些疑难病例用普通的PCR法很难检测到M.Tb,而用巢式PCR却可以诊断，

鉴于此，作者预测，如果该项技术得到合理的广泛临床应用，他将是精确快速诊断CNS结

核最有效的工具。

尽管我们都期望在临床上能广泛应用巢式PCR法，但令人遗憾的是，现在还很少用于

TBM的诊断。存在的主要争议在于，该法步骤繁多，而且很费时，不适合在临床上作为常

规检测手段。此外，因该法显著增加了敏感性且需要额外的扩增步骤，所以，一般来说会很

容易发生交叉污染。当然，巢式PCR不适合对许多样本进行临床常规的甄别检查。然而，

即便可用其他简单方法检查诊断TBM,但是阴性结果并不能排除感染M.Tb的可能性,因此，

用适宜的临床检测手段诊断TBM依然是一大难题。在急性临床阶段，CNS结核需要的不是

甄别性检测而是一个确定性的检查。因此，如果将巢式PCR用于从TBM高度疑似患者中收

集的明确适当的临床标本中，他应该是一项非常有用的技术。最后，用巢式PCR诊断CNS

结核的另一难点在于他需要配备一个合适的实验室以应用这一精确的技术;就现实情况而言,

在TBM高度流行区，常常没有这种条件。这是CNS结核诊断中一个至关重要的问题，需要

得到尽快解决。

7、用于CNS结核诊断的PCR技术的新进展

最近，为快速诊断CNS结核，作者开发了一种新型内控宽量程定量巢式实时PCR法

（WR-QNRT-PCR）,用于M.TbDNA的检测。该技术既有巢式PCR的强敏感性，又有实时定

量（TaqMan）PCR的精确性。（图2a）

在WR-QNRT-PCR中，需准备“野生”（W）和“新突变”（NM）两种原质粒，用来定量检测

M.TbDNAo在W-质粒中将一个239个碱基对的MPT64基因片段插入到pCR2.1载体中，作

为标准模版（图2b）。NM-质粒在W-质粒基础上进一步突变，在iWR-QNRT-PCR中作为一个

新的内控“校准器”（图2b）。在NM-质粒中，五个区中包含两对（内部和外部）正向和

方向引物对，和一个TaqMan探针退货位点，用人工随机核酸置换这些位点（图2b）。将人

工随机核酸序列设置成与野生M.TbMPT64序列核酸组成一致的序列。制备四对特异性引物

和两种特异性TaqMan探针，以备用于WR-QNRT-PCR中。表2和图2b显示了这些引物和探

针的序列和位置。对野生M.Tb或W-质粒的MRT64序列来说，两对正向和反向引物（WF1和

WR1两个外部引物用于第一步，TqMn-WF2和TqMn-WR2两个内部引物用于第二步）和

TaqMan探针（TqMn-W-VIC）是特异的。相比而言，对NM-质粒中用作新内控“校准器”的人

工随机核酸来说,两对正向和反向引物（MF1和MR1两外部引物及TqMn-MF2和TqMn-MR2

两内部引物对）和TaqMan探针（TqMn-M-FAM）是特异的。这些引物和探针的核酸组成均设置

成一样的，但是序列不同，是随机分布的（表2）。因此，我们可以认为，这些引物和探针

跟野生MPT64或NM-质粒的退火效率是相同的。

WR-QNRT-PCR法包含两步连续的PCR扩增，第一步为传统的普通PCR,第二步为实时

（TaqMan）PCR（图2a）。在该法中，整个程序包括在相同的分析条件下同时提取、扩增和检

测M.TbDNA及作为新内控的NM—质粒，这需要用针对各自模版有着相同退火效率的四对

引物和两个探针。因此，在CSF标本中，根据扩增率和新内控校准器（NM质粒）的关系，

可计算M.TbDNA的起始拷贝量，计算公式如下：X:W=C:M.\X=WXC/M.（X,每毫升

CSF样本中M.TbDNA的起始拷贝量；C,新内控的起始拷贝量（="校准器”103NM质粒

拷贝）；W和M,分别为提取和扩增后，M.TbDNA和NM-质粒的拷贝数。）人们普遍认为,

在M.Tb中，MPT64基因一次拷贝代表一个细菌。因此，我们可认为用WR-QNRT-PCR法计

算的拷贝数与CSF样本中M.Tb的细菌数有关。

WR-QNRT-PCR法需要两个定量检测M.TbDNA和新内控物NM-质粒的特异性标准曲线。

在实时（TaqMan）PCR中，标准曲线的精确度是影响定量检测的首要因素。图2c和2d展示了

两个特异性标准曲线。在样本回归分析中，两标准曲线均显示Ct值（y轴）和每一标准模

版的起始拷贝数的对数（X轴）有显著的线性相关（R2>0.99）。两因素ANOVA法显示，在重

复区组实验中两个标准曲线均无显著性差异（n=10;F=1.007,P=0.65和F=1.015,P=0.53）,

根据标准曲线的斜率可计算出实时PCR的PCR效率（E用。公式如下:PCR效率=10（-1/斜率）-1.

两个标准曲线的斜率分别为（-3.33和-3.28）,通过该公式可得PCR效率（E用分别为99.7和

101.8%。这些结果表明，WR-QNRT-PCR法中，M.TbDNA和新内控物的扩增和检测效率几乎

一样。

当将NM-质粒103拷贝数的值设置为新内控的最优拷贝数时，NM-质粒扩增曲线显示

作为模拟M.TbDNA的W-质粒的所有起始拷贝数（1-105）有着显著的统一模式（图2e）。

此外，用单因素ANOVA法（图2f）,NM-质粒103拷贝的Ct值显示所有W-质粒的起始拷贝

数间的均方有统计学意义（F=1.086,P=0.774）。这些结果表明在整个PCR扩增过程中，M.Tb

DNA和新内控之间没有干扰。因此，我们可以认为在WR-QNRT-PSR法中，NM-质粒可作为

内控”校准因子）。NM-质粒的发展，使得WR-QNRT-PCR法有稳固的统计学意义，使在宽检

测范围（1-105）进行M.TbDNA检测成为可能。

作者检测了WR-QNRT-PCR法在CNS结核的精确快速诊断及其临床过程评估中的效果。

作者收集了1998-2005年间24位TBM疑似患者和29位非TBM患者的标本。从24位患者

中收集了67份CSF样本，在这些样本中，有43份是从10位（3号和8-16号病例）随访超

过2周的患者中得到的连续性标本。表3总结了24位疑似TBM患者入院时（在ATT之前）

的临床特征.所有的24位患者达到了（A）临床标准并（B）符合TBM特征（如表3所述），有8

个确诊病例（1-8号病例）（M.Tb的CSF培养阳性）和16个高度疑似病例（9-24号病例）（符

合所有临床标准，有3个佐证诊断的阳性结果，但是未分离出病菌）。在临床应用中，对这

24位临床TBM疑似患者来说，WR-QNRT-PCR法显示了足够高的敏感性（95.8%）和特异性

（100%）o表3列出了测得的每毫升CSF中M.TbDNA的拷贝数。在传统的logistic回归中，每

毫升CSF中M.TbDNA的拷贝数>8000,是导致TBM预后不良（=死亡）的独立危险因素（OR=

16.142,95%CI=1.191-218.79,*P=0.0365）。在历时研究中，在10位TBM疑似患者的临床治

疗过程中，M.TbDNA的拷贝数有显著改变。这10位患者包括2个确诊病例（3号和8号病

例）和8个高度疑似病例（9-16号病例），在从3号和8号患者临床治疗过程所收集的43

份CSF标本中，只有3份M.Tb培养结果为阳性。相比之下，用WR-QNRT-PCR法进行M.TbDNA

的定量检测显示有25份CSF标本阳性。止匕外，有8位患者（8-14号和16号病例）ATT有效

且其临床分期和常规CSF结果在临床疗程中均得到改善，M.TbDNA的拷贝数逐渐减少到低

于WR-QNRTPCR法的检测限（图2g）。然而，在3号和15号病例中，ATT无效并死于TBM

恶化，在整个临床过程中，拷贝数持续增高（图2g）。重复测量ANOVA显示，在临床治疗

过程中，ATT有效（8、14、16号病例）和无效（3和8号病例）患者的M.TbDNA拷贝数改

变趋势有着显著差异（*P=0.0041）（图2g）。在11和12号病例中，入院时颅部MRI显示多

个颅内局灶性肿物，认为是典型的结核瘤（表4和图2h）。在进行ATT过程中，WR-QNRT-PCR

法显示阴转后，这两个结核瘤病例再次显示无任何脑膜炎症状的瞬态阳性。一般来说，结核

瘤患者常伴有TBM,当然在无TBM的情况下结核瘤也会发生。随访MRI显示，这两例结核瘤

分别在ATT5个月和3个月后消失（表4）。有意思的是，随着结核瘤的消失，WR-QNRT-PCR

结果显示为完全阴性。作者推断在ATT期间，用WR-QNRT-PCR法对这两个病例进行M.TbDNA

的瞬态检测与结核瘤有关。在结核瘤中存在少量M.Tb。ATT可使结核瘤破裂，随着它的破裂

会有少量M.TbDNA渗入CSF中，高度敏感的WR-Q.NRT-PCR法可能会检测到这些DNA.这些

结果表明，在急性临床病例中，可用基于分子的技术和神经放射成像技术相结合的方法作为

诊断TBM和结核瘤的强效方法。众所周知，目前尚无有关这两个病例的报道；因此，我们

可认为他们在临床上十分重要。而且，在简单回归分析中显示M.TbDNA拷贝数和TBM临床

分期显著相关（R2=0.597,*P<0.0001）（图2D。这些历时研究结果表明WR-QNRT-PCR在评估

TBM临床过程和ATT反应的定量分析时非常有用。众所周知，以前的研究中，没有对CNS

结核整个临床过程的CSF样本中M.Tb的细菌数和DNA量的报道。将WRQNRT-PCR用于急性

临床阶段定量检测CSF中M.TbDNA,因为把NM-质粒作为新内控，所以该法有着显著的精

确度和可信度。因此，我们可认为，在CNS结核的快速精确诊断中，这是一种先进高效的

方法。

然而，这种新技术尚未广泛用于临床常规检查。可能是WR-QNRT-PCR法需要两步连续

扩增，步骤繁杂。因此，作者正在研发新的简易实惠的定量和高敏感技术，使之可以和一步

的标准实时PCR发展而来的WR-QNRT-PCR法相媲美。这种正在研发的方法结合了全基因组

扩增（WGA）和实时（TaqMan）PCR技术。全基因组扩增为少量优质DNA扩增成为可能并且其

中的几项技术可用于商品化试剂盒，价格合理。特别值得一提的是，这些应用WGA法的试

剂盒采用的是多重置换扩增（MDA）技术，该技术已经应用于许多研究中，实现了基因组的均

衡扩增。MDA技术是一种优越的方法，该法用Phi29DNA噬菌体多聚酶和随机六聚体引物

实现了基因组DNA的持续扩增。在该项研究中，作者用的是基于MDA技术的GenomiPhiV2

试剂盒（GEHealthcareLifeSciences,Uppsala,Sweden）o因为直接用GenomiPhiV2试剂盒即可

提取和纯化CSF中的少量M.TbDNA,使其作为模版,WR-QNRT-PCR法中的第一步即可省略。

现行WGA法的改进可显著简化WR-QNRT-PCR法。因此，尽管该技术仍有待于研究，但是

我们都期待这种经济的临床检测方法可广泛进行临床实际应用。

如上所述，包括TBM在内的CNS结核是M.Tb感染的最严重形式，会引起死亡和严重

的后遗症。此外，由于AIDS流行引起免疫功能不全个体及高龄人群不断增加，再加上皮质

激素等免疫抑制剂的广泛应用，使得CNS结核依然是一个严重的临床和社会问题。特别是

在亚洲和非洲这样的不发达国家和发展中国家，有着许多日益加剧的社会问题，如贫困、人

口过多。营养不良等等，这使得包括TBM在内的M.Tb感染流行，成为一个严重的社会和人

口统计学难题。作者认为我们有必要发展新技术并且使这些技术能够在这些地方应用。我们

所研究的新技术的广泛应用将导致TBM早期确诊病例增加进而改善TBM的疗效；因此，他

们为这些国家做出了巨大的医学和社会贡献。我们努力开发新的，更为快速、精确、敏感、

简易、实惠且能定量的诊断CNS结核的技术，我们希望这种努力有助于改善全球的医疗护

理，特别是在不发达国家和发展中国家。

8、结论

近期，在快速精确诊断CNS结核方面，除了基于细菌学的传统的“金标准”，我们尝试了各

种方法。本文对近期NAA法（主要是PCR技术）的进展做一综述。特别是巢式PCR法的发

明，为CNS结核的诊断做出了重要贡献。WR-QNRT-PCR法有内控物并结合了高度敏感的巢

式PCR和精确实时定量PCR,被认为可快速诊断TBM,尽管如此，该法尚未用于临床常规检

查。这种新技术有高敏感性且能精确定量，不仅能用于CNS结核的诊断，还能预测预后，

评估TBMATT过程中的疗效。因此，我们希望该法能广泛用于CNS结核急性临床阶段的诊

断。

甲状腺癌的分子诊断的最新进展

最常见的内分泌肿瘤甲状腺癌的发病率在过去十年中日益增加。滤泡起源的甲状腺癌的

组织学分型有甲状腺乳头状癌（PTC）,甲状腺滤泡状癌（FTC），和甲状腺未分化癌（ATC）.

良性甲状腺肿瘤（BTA）是常见的内分泌肿瘤。另一方面，甲状腺髓样癌并非滤泡细胞起源，

而是起源与滤泡旁细胞或C细胞，因此，在此不做赘述。

大量研究表明，高治愈率的分化良好的甲状腺癌（WDTC）,滤泡细胞起源的甲状腺肿瘤，

到常常致命的甲状腺未分化肿瘤是逐级进展的。低分化的甲状腺癌及WDTC的侵袭性变体

（如高细胞和柱细胞）常为这一生物连续性进展模型中的中间体。

临床、流行病学及病理学均有证据支持该逐步进展和去分化这一概念。例如，伴随着有

丝分裂，坏死，及核的多形性的出现，在侵袭性甲状腺肿瘤中可见乳头状及滤泡状增长的逐

步消失，与此同时稳健增长逐步加强。这些肿瘤中大部分含有分化的甲状腺肿瘤的残余灶。

在临床医治甲状腺癌时，常常会难于诊断。原因之一在于评估甲状腺结节时广为应用的

细针吸取标本（FNAB）为模棱两可的细胞学。如在美国，每年在甲状腺结节的300000个病例

中，大部分为BTA.而且，20-30%的FNAB显示为模棱两可的细胞学表现，这一报告模式在

过去的20年来一直没变。尽管相当多的患者为良性结节，但他们为使结节完全回复常态，

全都选择手术治疗。

在甲状腺癌患者进行合适的外科治疗和药物治疗中，谨慎的风险分层是其中关键的一步。

这种风险评估通常基于临床病理学因素，这种评估可信度低且大部分时候不能在甲状腺手术

前得到结果。

大部分甲状腺癌患者的愈后都非常好。一般的治疗包括全甲状腺切除，在疾病进一步发

展阶段，用放射碘（1-131）疗法进行残余物消融或治疗。只有肿瘤表形与正常甲状腺一样，存

在通过TSH受体和碘盐共输体（NIS）的表达对生长因子TSH有反应时，这些治疗方法才能见

效。用颈部超声等解剖成像、全身放射碘扫描和带有抗甲状腺球蛋白抗体的特异性甲状腺球

蛋白血清学测定等方法对患者进行监测。

在另一方面，伴有再发性或代谢性疾病的甲状腺癌患者其死亡率高达50%。甲状腺癌的

去分化包括TSH受体表达的丢失，NIS,和甲状腺球蛋白的丢失。在肿瘤不能进行NIS表达过

程中，临床医生也不能用放射碘进行监测和治疗。然而，处于该状态的肿瘤在18F-脱氧葡萄

糖正电子发射断层扫描（FDG-PET）中可见。就临床而言，对于FDG-PET阳性的非碘敏感肿

瘤的治疗方法有观察、附加手术、外部离子束照射，还有像美国FDA认证的doxorubicin化

疗药物，及临床实验。

近来引进的靶向治疗药物有多个靶点，包括受体酪氨酸激酶，非受体酪氨酸激酶，和丝

氨酸苏氨酸激酶，这些药物为甲状腺癌沉珂患者带来了福音。

分子医学的现行目标是能够描绘每位患者的肿瘤，以决定用何种方法来达到最佳疗效。

在基因和/或表观遗传调节等肿瘤生物学领域其概念的阐述和技术方面有着显著进步，但在

甲状腺致癌基因中却缺乏统一的理论。本综述旨在提供一个框架，以了解相关研究该如何发

展才能针对不同肿瘤基于相应治疗。

2、染色体重排

在甲状腺乳头状癌中最早能识别的基因改变为原癌基因RET（转录时重排）的染色体改

变。此RET原癌基因是位于10号染色体长臂近端的21号外显子,他可编码酪氨酸激酶受体。

他涉及神经崎起源细胞的生长，生存，分化和移动的调节。正常情况下，他不在卵泡细胞中

表达。易发生异位基因部位有独特的空间接近性，这可以在甲状腺有丝分裂中期、favorsRET

基因重排时优先发生，这就是甲状腺肿瘤中RET重排具有特异性的原因。

尽管有10多个重排得以描述，但是在PTC中发现的重排大部分是RET/PTC1,RET/PTC2,

和RET/PTC3。这些重排中管家（或普遍表达）基因的上游（5'端）元件能驱使RET酪氨酸

激酶区域表达。融合基因提供的异源引物有助于RET/PTC嵌合蛋白的表达，导致乳头状癌细

胞中RET受体酪氨酸激酶中组分及依赖性配体的激活。

临床上，在放射相关RTC中常可发现RET/PTC变体。1986年切尔诺贝利核电厂爆炸后

小儿甲状腺癌增加导致甲状腺癌两个组分的形成。第一个为可早期发现并有侵袭性的PTC

稳固变体，他含有RET/PTC3重排。而第二个PTC为带有更为典型的表型和临床过程，在切

尔诺贝利核爆后的生存者中含有RET/PTClo

转基因小鼠和体外细胞作用均表明这些融合蛋白能启动PTCo在甲状腺未分化癌中

RET/PTC重排并不常见，这表明这些肿瘤可用常规疗法处理。而且，用RET/PTC法识别来自

FNA的甲状腺结节诊断PTC已经开始启用。

有证据表明RET/PTC重排代表导致PTC进展的早期基因改变。约有20%不定期发生的

PTCS中可见RET/PTC重排。而且在甲状腺皮质和其他良性损伤中也可见RET/PTC重排。然而，

既然这种重排见于大部分肿瘤细胞，我们就有理由认为他具有PTCS特异性。

有几项研究表明与PTC有关的RET/PTC重排缺乏进展到PDTC或ATC的证据。近期

Santoro等人的研究表明显示RET/PTC重排的PDTCs少于10%„因此他们得出结论：相对而

言，带有RET/PTC重排的PTC发展为PDTC或ATC的可能性较小。

近来已经发现有显著抑制RET酶活性的复合物。特别是在用甲磺酸伊马替尼（可激活

ABL激酶的抑制因子）治疗慢性髓性白血病方面取得了显著成效，这一成功显著促进了治疗

性蛋白激酶抑制因子的研究。有对抗RET活性的多种药物正处于试验阶段，最值得关注的有

ZD6474-Vandetanib和Bay43-9006-Sorafenib,但是这些药物也作用于其他酪氨酸激酶受体。

特别是Sorafenib,他在两次二期临床试验中的有效率分别为15%和23%,由于Vandetanib

有阻断RET信号活性才能力，他率先应用于髓性甲状腺癌患者，然而，对于DTC患者，还

正处于二期临床试验。

3、RAS突变

在3型甲状腺癌，丝裂素活化蛋白激酶、胞外信号调节酶（RAS/Raf/MEK/ERK）和磷脂酰

肌醇-3激酶（PI3K）/Akt信号转导途径中，RAS（Rat肉瘤的简写形式）癌基因家族调节两个重

要的信号转导途径。良性和恶性甲状腺肿瘤中均可见RAS突变，在ATCs中有可变频率。

由H-RAS,K-RAS,和N-RAS三个RAS基因合成的21-kDa蛋白质家族在肿瘤形成过程中

起重要作用。RAS蛋白有两种存在形式：一种为富含二磷酸鸟甘（GDP）的非活性形式和富含

三磷酸鸟甘（GTP）的活性形式。他们能将起于酪氨酸激酶膜受体的信号传给级联的有丝分裂

素激活蛋白激酶（MAPKs）。这将激活靶基因的转录、细胞的增殖、存活和凋亡。在外显子

1GTP结合区域（密码子12或13）或外显子2GTPase区域（密码子61）的点突变可激活致

癌基因RAS,这可使蛋白质处于激活状态并导致下游靶位的慢性刺激，基因组的不稳定性，

额外的突变和恶性转化。RAS突变是转化细胞中最常见的突变之一。在良恶性甲状腺肿瘤中

均可见三种RAS基因的突变。他们在滤泡癌，PDTC,和ATC中均较常见，在PTC中较少。

RAS致癌基因在甲状腺肿瘤发展过程中的作用还不清楚。

一些研究表明在良恶性甲状腺肿瘤中RAS突变盛行率相当，这说明RAS激活么能代表

着早期事件。另外一些研究表明RAS突变特别是N-RAS61号密码子的突变与肿瘤的进展和

侵袭性临床表现有关。伴有甲状腺特异性RAS表达突变的转基因小鼠会发展为甲状腺增生

和甲状腺肿瘤。Garcia-Rostan等人近期研究显示RAS突变预示着WDTC独立肿瘤阶段的预后

不好。

而且，他们发现PDTC和ATC常有多个RAS突变。这些突变可能代表甲状腺肿瘤进展过

程的中间阶段。

4、甲状腺癌中的BRAF突变和MAP激酶信号转