DB13T 2609-2017 禽流感病毒与新城疫病毒二重RT -PCR检测方法

ICS65.020.30DB13/T2609—2017禽流感病毒与新城疫病毒二重RT-PCR检测方法2017-11-22发布2017-12-22实施IDB13/T2609—2017本标准由河北农业大学提出。李丽敏、白云、韩庆安。1DB13/T2609—2017禽流感病毒与新城疫病毒二重RT-PCR检测方法2缩略语EB:溴化乙锭(ethidiumbromide)PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction)RT-PCR:反转录-聚合酶链式反应(reverse-transcriptionpolymeradNTP:脱氧核苷酸三磷酸(deoxy-ribonucleosidetriphosphate)3试剂或材料脂糖凝胶，50×TAE缓冲液，溴化乙锭(EB,10ug/μL)或核酸染料，焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的3.1LSTRIzolRNA提取试剂或病毒核酸提取试剂盒。3.31.0%琼脂糖凝胶，配制方法见附录A中A.1。3.450×TAE缓冲液，配制方法见附录A中A.2。3.5溴化乙锭(EB,10ug/μL)或核酸染料，配制方法见附录A中A.3。3.6焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的灭菌的双蒸水，配制方法见附录A中A.4。3.7DNA分子量标准(100bp):包含100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp几种分2DB13/T2609—20173.11dNTP。浓度为2.5mM。5样品下列的采集工具应经121℃±2℃,20b)剪刀；3DB13/T2609—2017样品采集后放入塑料袋内密封(一个采集点的样品放一个塑料袋内),于保温箱中加冰，密封24h将所采集的组织至于洁净、灭菌并烘干的搪瓷盘中，称取组织按照质量体积比(1:5)加入样品保6.1.1用LSTRIzol试剂提取待检样品(棉拭子或组织)、阳性对照及阴性对照样品的RNA。6.1.2将250μL经过预处理的待检样品(棉拭子或组织)加入750μLTRIzolLSReagent中，振荡2min,室温放置5min。6.1.3加入250μL氯仿，在微量振荡器上振荡1min,室温放置5min后，4℃条件下12000r/min离心15min。12000r/min离心15min。6.1.5小心吸弃上清，加入DEPC处理的75%乙醇700μL～800μL,4℃条件下12000r/min离心5min。涡旋混合15s,56℃孵育15min。6.1.8.2加入250μL无水乙醇，涡旋混合15s,室温放置5min。6.1.8.3将溶液和沉淀一起加入离心柱中，12000r/min离心1min,弃掉流出液。6.1.8.4加入500μLWB5,12000r/min离4DB13/T2609—20176.1.8.5室温12000r/min离心1min,彻底去除残留的乙醇，在室温静置1～3min彻底晾干离心柱。6.1.8.6将离心柱转入1.5mL离心管中，并向离心柱中央加20μLRNase-freeWater,室温静置6.1.8.7室温12000r/min离心1min,洗脱RNA。6.1.8.8提取的RNA应在2h内进行RT-PCR扩增，若需长期保存，应至于-80℃的冰箱保存。6.2.1反转录反应(cDNA的合成)6.2.2PCR反应经充分混匀后瞬时离心使液体全部聚集于管底。延伸5min。扩增反应结束后立即进行电泳或置于4℃条件下备用。7试验数据处理7.1扩增产物的电泳检测扩增产物加到凝胶孔，加入DNA分子量标准(100bp)。恒压(110V)电泳30min～40min,将电泳好的凝胶放到凝胶成像系统上观察结果。7.2结果判定阳性对照的扩增产物经电泳检测，在预期大小的条带位置均出现特异性的条带，阴性的扩增产物没有预期的目的条带，阴阳性同时成立表明试验有效，否则试验无效。在试验结果成立的前提下，如bp位置出现特异性的条带，则判定为禽流感病毒核酸检测阳性；如bp位置出现特异性的条带，则判定为新城疫病毒核酸检测阳性。如bp和297bp位置均出现特异性的条带，则判定为禽流感病毒与新城疫病毒核酸检测双阳性；如果样品的RT-PCR产物电泳后在428bp和297bp位置均未出现特异性的条带，则判定为禽流感病毒与新城疫病毒核酸检测双阴性。RT-PCR产物电泳图见附录C中C.1。8试验报告依次陈述试验对象、所使用的标准(包括发布或出版年号)、所使用的方法、检测结果与试验时5DB13/T2609—20(规范性附录)相关试剂的配制A.11.0%琼脂糖凝胶称取琼脂糖1.0g,放入100mL1×TAE电泳缓冲液中，加热融化，温度降至60℃时，加入5μL核A.250×TAE电泳缓冲液A.2.10.5mol/LEDTA溶液(pH8.0)称取EDTA18.61g,加灭菌双蒸水至100mL,后用氢氧化钠调pH至8.0。A.2.2TAE电泳缓冲液(50×)Tris242g,冰乙酸57.1mL,0.5mol/LEDTA100mL,加灭菌双蒸水至1000mL。A.3溴化乙锭(EB)溶液溴化乙锭20mg,加灭菌双蒸水至20mL。焦碳酸二乙酯(DEPC)50μL,加灭菌双蒸水至100mL,室温放置6h～8h,121℃±2℃高压灭菌20min,分装到1.5mLDEPCA.5PBS缓冲液A.5.1A液(0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液):NaH₂PO₄·H₂027.6g先用适量蒸馏水溶解，最后用蒸馏水稀释至1000mL。A.5.2B液(0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液):Na₂HPO₄·7H₂053.6g,(或Na₂HPO₄·127H₂O71.6g或NaHPO₄·2H₂O35.6g)先用适量蒸馏水溶解，最后用蒸馏水稀释至1000mL。A.5.30.01mol/LpH7.2磷酸盐缓冲液的配制：A液14mL,B液36mL,加氯化钠(NaCl)8.5g,最后用蒸馏水稀释至1000mL。6DB13/T2609—2017(规范性附录)引物名称引物浓度序列(5'-3’)AIV-decFCGTAGACGCTTTGTCCAGAATGCAIV-decRGTCCTCATTGCCTGCACCATCNDV-decFCG