鹿主要传染病的研究进展

杜锐吉林农业大学中药材学院鹿主要传染病的研究进展汇报内容1、牛病毒性腹泻黏膜病2、鹿口蹄疫病3、鹿结核病4、鹿布氏杆菌病牛病毒性腹泻黏膜病临床症状流行情况分离鉴定诊断方法新型疫苗药物筛选临床症状概述流行情况牛感染BVD鹿感染BVD概述流行情况（柱形图）概述

E0产生的中和抗体能中和BVDV和CSFV，且在这一蛋白内有一高度保守结构域，因此它可用于研究亚单位疫苗。

E2

的N端既是决定BVDV抗原性的主要部位，也是与抗BVDV抗体结合、介导免疫中和反应及与宿主细胞识别、吸附的主要部位。

研究进展N71株接种MDBK细胞的病变正常MDBK细胞对照BVDV分离鉴定BVDV分离鉴定N71株细胞培养物电镜负染观察（80,000倍）N71株与长春184株免疫荧光交叉试验结果BVDV分离鉴定N71毒株TCID50测定结果:10-5.4。N71毒株理化特性测定结果

检测项目处理TCID50/0.1mL

乙醚敏感试验处理组

100

对照组10-5.2

氯仿敏感试验处理组

100

对照组10-5.0

胰蛋白酶敏感试验处理组

10-2.0

对照组10-5.2

酸碱度敏感试验处理组(pH3.0)

10-0.8

对照组(pH7.2)10-5.2

处理组(pH9.0)

10-4.8

温度敏感试验50℃30分钟10-4.650℃60分钟10-3.550℃70分钟10-1.556℃30分钟10-3.256℃60分钟10-2.356℃70分钟100BVDV分离鉴定N71毒株中和试验结果

项目处理TCID50/0.1mL10-110-210-310-410-510-610-7

MDV阳性血清0/40/40/40/40/40/40/4100MDV阴性血清4/44/44/44/42/41/40/410-5.1

对照4/44/44/43/43/41/40/410-5.212341631bp517bp396bp344bp298bp221bpRT-PCR扩增产物琼脂凝胶电泳1.为正常细胞对照2.为长春184株3.为N71株4.为PBR322DNA/HinfIMakerBVDV分离鉴定双抗体夹心法检测BVDV抗原结果判定：凡P/N值大于或等于2.0的样品为阳性；凡P/N值小于2.0的样品为阴性。BVDV血清学诊断BVDV血清学诊断显色间接法检测BVDV抗体与待测抗体孵育与酶标抗体孵育加入底物包被已知抗原结果判定：凡P/N值大于或等于2.0的样品为阳性；凡P/N值小于2.0的样品为阴性。BVDV血清学诊断BVDVRT-PCR诊断

根据牛病毒性腹泻病毒NADL株的NS2-3基因和E0基因序列，设计合成了2对BVDV引物，对分离毒株进行RT-PCR鉴定。NS2-3的RT-PCR鉴定E0的RT-PCR鉴定BVDVRT-PCR诊断BVDVRealtime-PCR诊断BVDV

Realtime-PCR诊断表达BVDV-E2的重组卡介苗BVDV基因工程疫苗研究进展

BVDV-E0核酸疫苗疫苗研究梅花鹿源BVDV分离株基因苗与灭活苗免疫家兔的抗体测定的OD值E0基因疫苗免疫试验BVDV-E0核酸疫苗免疫试验梅花鹿源BVDV分离株基因苗与灭活苗免疫家兔的抗体OD值统计结果E0基因疫苗免疫试验梅花鹿源BVDV分离株基因苗与灭活苗免疫家兔血清抗体比较趋势图E0基因疫苗免疫试验T，B淋巴细胞转化实验结果PHA、LPS刺激前的淋巴细胞PHA、LPS刺激后的淋巴细胞组别PHA刺激A570值LPS刺激A570值Ⅰ0.186±0.011a0.168±0.020aⅡ0.414±0.044b0.289±0.025bⅢ0.405±0.055b0.304±0.026cⅣ0.394±0.036c0.313±0.037cⅤ0.407±0.047b0.308±0.043bⅥ0.219±0.019a0.308±0.043bⅦ0.271±0.022b0.256±0.026bⅧ0.284±0.026c0.331±0.031bⅨ0.278±0.029c0.260±0.028cⅩ0.184±0.013a0.162±0.017a鹿BVDV分离株核酸疫苗细胞免疫检测结果(A570)E0基因疫苗免疫试验E2rBCGBCGBVDpMV361-E2BVDVBVDV-E2基因重组卡介苗的构建

重组卡介苗菌落图BVDV-E2基因重组卡介苗的构建97.266.444.329.020.114.344KD12M

pMV261-E2重组卡介苗免疫印迹检测结果M1244KDBVDV-E2基因的穿梭表达载体的构建及表达pMV261-E2重组卡介苗SDS结果44kDM12pMV361-E2重组卡介苗SDS结果97kD66kD44kD31kD20kD14kD44kDpMV361-E2重组卡介苗免疫印迹检测结果BVDV-E2基因的穿梭表达载体的构建及表达分组免疫家兔采集血液T淋巴细胞转化（MTT）间接ELISA

（结核和BVD）动物实验组别pMV361-E2重组卡介苗pMV261-E2重组卡介苗pMV361空载体卡介苗pMV361空载体卡介苗BCG对照组BVDV对照组生理盐水对照组

免疫次数：共3次免疫间隔：两周BVDV-E2基因重组卡介苗的构建重组卡介苗组与对照组免疫家兔BVDV血清抗体比较趋势图BVDV-E2基因重组卡介苗的构建

重组卡介苗组与对照组免疫家兔结核病抗体比较趋势图BVDV-E2基因重组卡介苗的构建重组卡介苗免疫家兔后淋巴细胞在E2蛋白刺激后增殖情况BVDV-E2基因重组卡介苗的构建BVDV-E2基因的优化表达

根据E2基因主要抗原位点设计5条引物，通过引物两两配对实现E2基因的部分扩增。引物序列：

F15-GCCGAATTCCTCCCAGCCTGTAAACCT-3;F25-GCCGAATTCGTGTGGTGTAAAGATGGAGAG-3；

D15-GCGATCGATTTAGAAGGTACATGCCGTC-3；

D25-GCGATCGAT

TTACAGCAGGGACTCAGCCG-3；

D35-GCGATCGAT

TTAACCTAAGGTCGTTTGTTCTAG-3。扩增产物：

F1D1－891bp(1-297aa)、F1D2－1035bp(1-345aa)、

F1D3－1122bp(1-374aa)、F2D1－755bp(45-297)、

F2D2－899bp(45-345aa)、F2D3－986bp（45-375aa）。BVDV-E2基因的优化表达E2基因不同片段的PCR扩增产物E2不同片段重组pMV261质粒双酶切鉴定BVDV-E2基因的优化表达E2不同片段重组pMV261质粒PCR鉴定重组质粒在卡介苗中的表达BVDV-E2基因的优化表达药物抗BVDV抑制率(%)敏感药物筛选的研究鹿口蹄疫病概述流行情况分离鉴定诊断方法VP1基因的原核表达口蹄疫病毒（FMDV）口蹄疫病毒电镜图片口蹄疫病毒核衣壳结构口蹄疫病毒基因组结构图概述流行情况概述分离株接毒24h的细胞病变分离株接毒48h的细胞病变分离株接毒48h的细胞病变正常对照细胞FMDV分离鉴定分离鉴定O型标准血清补反结果C型标准血清补反结果A型标准血清补反结果AsiaⅠ标准血清补反结果分离鉴定RT-PCR扩增结果1.分离株细胞培养物2.DNAMarkerDL200050nmFMDV

电镜照片分离鉴定间

接

法

检

测

FMDV

抗

体FMDV血清学诊断间接ELISA特异性阻断实验结果样品号123456未阻断组0.430.450.490.430.470.43阳性血清阻断组0.140.130.120.110.120.12阴性血清阻断组0.140.130.130.120.120.11间接ELISA实验敏感性实验结果血清稀释度1﹕1001﹕2001﹕4001﹕8001﹕16001﹕32001﹕6400OD值0.460.440.410.310.250.180.13间接ELISA实验重复性实验结果样品编号阳性样品阴性样品ⅠⅡⅠⅡ10.450.440.130.1520.430.460.130.1430.420.400.140.1340.450.450.130.1550.420.430.140.1360.440.460.140.15血清学诊断FMDVYT株VP1基因RT-PCR结果123pGEMT-VP1PCR鉴定1220001000750500250100

pGEMT-VP1的酶切鉴定FMDV-VP1基因的原核表达

FMDV-VP1基因的原核表达表达载体pET-28a(+)双酶切pGEM-VP1质粒双酶切FMDV-VP1基因的原核表达重组载体pET-28a（+）-VP1酶切鉴定重组质粒pET-28a（+）-VP1PCR鉴定FMDV-VP1基因的原核表达pET-28a（+）-VP1的IPTG诱导浓度优化pET-28a（+）-VP1的诱导时间优化FMDV-VP1基因的原核表达pET-28a（+）-VP1免疫印迹检测结果FMDV-VP1基因的原核表达免疫规程：

1.免疫用疫苗口蹄疫O型、亚洲Ⅰ型二价灭活疫苗。

2.免疫对象成年、育成、90日龄以上的公、母鹿均可。

3.免疫用法与用量

3.1所有鹿首免时均采用二次免疫法，即第一次免疫后20～30天再免疫一次。

3.2免疫途径为颈部或臂部肌肉注射。

3.3免疫用量成年和育成鹿2ml/每头，90日龄以下仔鹿1ml/每头。

6.免疫期免疫保护期6个月。鹿结核病概述研究进展概述1病原学

病料中分枝杆菌形态

纯培养的分枝杆菌形态

珍珠样结节

结节坏死

2症状及病理剖检畸形茸

3流行情况31%~42%欧洲亚洲北美洲大洋洲

一、诊断方法

如涂片镜检，细菌培养

如PCR技术，核酸探针技术细菌学检验方法

分子生物学检测方法

如ELISA法，皮内变态反应免疫学检测方法研究进展1.牛分枝杆菌2.鸟－胞内分枝杆菌3.偶发分枝杆菌4.堪萨斯分枝杆菌5.戈氏分枝杆菌6.苏尔加分枝杆菌7.无色分枝杆菌8.瘰疬分枝杆菌9.未能定型

1.细菌学检测方法细菌分离2.免疫学检测方法

结核菌素试验如（OT点眼实验）

酶联免疫吸附试验（ELISA）实践证明变态反应检测ELISA检测+可有效提高检测的准确性

即对结核菌素点眼实验阴性者和可疑者进行ELISA检查，ELISA阳性者判为结核阳性鹿，ELISA阴性者判为结核阴性鹿（即点眼和ELISA双阴性鹿）。

3.分子生物学学检测方法鹿结核病PCR检测法的建立

1牛分枝杆菌和结核分枝杆菌二联PCR检测方法的建立

2鹿结核病的荧光定量PCR检测方法的建立3鹿结核病的PCR检测法的建立

1上游引物A1：5’-ACCACCGAGCGGTTCGGCTGA-3’

下游引物A2：5’-GATCTGCGGGTCGTCCCAGGC-3’Pab：419bpPCR123456M

419bp2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp

图1复合群特异性试验电泳图1大肠杆菌2巴氏杆菌3非结核分枝杆菌4副结核杆菌5牛分枝杆菌6结核分枝杆菌M:DNAMarkD419bp2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp12345M

图2复合群敏感性试验电泳图

1~5：1×10-8、1×10-6

、

1×10-4

、1×10-2、1×10-1

结果12345678M910

419bp2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp图3部分鹿样本的检测电泳图1~8检测样品；9阳性对照；10阴性对照；M:DNAMarkDL200012M345678910图4部分鹿样本的检测电泳图

3~10检测样品；1阳性对照；2阴性对照；M:DNAMarkDL2000419bp2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp结果

根据基因库牛分枝杆菌特异性基因和结核分枝杆菌23SrRNA分别设计引物B1、B2和M1、M2。上游引物B1：5'-GCGAACGCGGAACAGGCTAAAC-3'631bp下游引物B2：5'-AGCTTATCCCCCGCCGTCTCA-3‘上游引物M1：5'-CTCTGAAATTCGCCTCTGTAA-3'838bp下游引物M2：5'-TCCGTCTGCACACCTTGTGC-3'’

牛分枝杆菌和结核分枝杆菌二联PCR检测方法的建立

22000bp1000bp750bp500bp250bp100bp结果838bp631bp2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp

图5测特异性试验电泳图

1大肠杆菌，2巴氏杆菌，3非结核分枝杆菌，4副结核杆菌，5牛分枝杆菌，6结核分枝杆菌，7混合模板M:DNAMarkerDL2000838bp631bp图6敏感性试验电泳图M:DNAMarkDL2000；1~5:1×10-1、1×10-2、1×10-4、1×10-6、1×10-8

1234567M

M12345838bp631bp2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp123456M78

910图7部分鹿样本的检测电泳图1~6检测样品；7阴性对照；8牛分枝杆菌阳性参照；9结核分枝杆菌阳性参照M:MarkerDNADL2000123456789

10M838bp631bp2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp图8部分鹿样本的检测电泳图

1结核分枝杆菌阳性参照；2牛分枝杆菌阳性参照；3阴性对照；4~10：检测样品M：MarkDNADL2000；4~10检测样品鹿结核病的荧光定量PCR检测方法的建立3表1序列及扩增片段长度名称序列扩增片段长度上游引物P15'AATACCGCACGGCTGATGG'3147下游引物P25'ACCTCCAGTCCAGGCTTCTCC'3探针5-FAM-CGGGATGGCAGACGCTTTCGG-TAMRA-32000bp1000bp750bp500bp250bp100bpM1147bp结果图9结核分枝杆菌PCR电泳图M:DNAMarkDL2000；1:结核分枝杆（1）鹿卡介苗（BCG）免疫的研究

二、免疫预防BCG免疫鹿的抗体消长规律

免疫规程：

1.免疫适应对象：3个月龄仔鹿直接接种；幼鹿和成年鹿接种前需进行旧结核菌素（OT）点眼，对点眼反应呈阴性者方能接种。

2.免疫用疫苗：人用冻干皮内注射BCG（0.75mg/支）。

3.免疫程序：

3.1免疫用量：仔鹿、幼鹿和成鹿一律每头每次0.75mg3.2免疫途径：颈部或臀部皮内和皮下接种均可。

3.3免疫接种次数：仔鹿实行连续三次接种（生后24h；次年4～5月；生后第三年4～5月份进行）。幼鹿和成年鹿实行二接种，间隔11～12个月。

4.禁忌：凡是结核病鹿、急性传染病和皮肤病患病鹿严禁接种。（2）BCG与流行株差异基因选择的研究

自然发病

人工免疫

无法区分差减杂交文库构建筛选出差异基因斑点杂交差异基因融合SOE法原核表达试验方法M12结果图14抑制性差减杂交结果1M:DNAMarkerDL2000;2差减杂交第二轮PCR产物；

3未差减杂交第二轮PCR产物结果图15差减组杂交效率检测

M:DNAMarkerDL2000;2PCR第18循环取样；3PCR第22循环取样；4PCR第26循环取样;5PCR第30循环取样

M1234图16未差减组杂交效率检测M:DNAMarker