常见干扰及消除技术学习培训课件

常见干扰及消除BET干扰的普遍性！一项对人用药品与鲎试验相容性的研究证实了干扰的影响范围，在所研究的品种中仅30%的药品可以不经任何处理直接进行BET；有97%的干扰问题可以通过稀释供试品的方法去消除。270%！3干扰的表现凝胶法Ch.P.2010规定无干扰条件：

0.5λ≤Es≤2λ；0.5Es≤Et≤2Es

USP35规定无干扰条件：

0.5λ≤Es≤2λ；0.5λ≤Et≤2λ平行管数溶液C（Es）2λλ½λ¼λ1＋＋－－2＋＋－－3＋＋－－4＋＋－－平行管数溶液B（Et）SE2λSEλSE½λSE¼λ1＋＋－－2＋＋－－3＋＋－－4＋＋－－最理想的无干扰状况表a4平行管数溶液C（Es）2λλ½λ¼λ1＋＋＋－2＋＋＋－3＋＋＋－4＋＋＋－平行管数溶液B（Et）SE2λSEλSE½λSE¼λ1＋－－－2＋－－－3＋－－－4＋－－－不符合Ch.P.要求，但符合USP要求表b5平行管数溶液C（Es）2λλ½λ¼λ1＋＋＋－2＋＋＋－3＋＋＋－4＋＋＋－平行管数溶液B（Et）SE2λSEλSE½λSE¼λ1＋＋＋＋2＋＋＋－3＋＋＋－4＋＋＋－符合Ch.P.要求，但不符合USP要求表c出现表b或表c的极端情况均为不适宜的实验结果，需要检查实验条件。67干扰的类型抑制供试品含有的内毒素浓度≥2倍检测试剂的灵敏度，但检测结果仍为阴性，称之为假阴性增强供试品含有的内毒素浓度低于检测试剂灵敏度的1/2，但检测结果仍为阳性，称之为假阳性光度法的判断？无干扰：50%≤回收率≤200%抑制：回收率＜50%增强：回收率＞200%8干扰的判断：回收率=？%50%200%无干扰增强抑制鲎试剂内毒素螯合剂聚集高渗透压酶、酶抑制剂TAL-RM脂质体吸附洗涤剂表面活性剂pH值干扰的因素！9pH值的影响鲎试剂中的酶需要在

pH值6~8的范围内才能正常反应，极端的pH环境影响酶的活性，造成抑制一般来说鲎试剂配方中都添加了缓冲剂以帮助样品的pH值的调节，但这不足以解决所有样品的pH问题测定以1:1为比例混合的样品稀释液+鲎试剂的pH值以获得准确的pH值10解决有关pH的问题1用BET水对供试品在允许的范围内进行稀释2用缓冲液制备供试品3用酸、碱或缓冲液来调节pH11螯合问题Mg2+离子是鲎试剂重要的辅因子，没有Mg2+离子，内毒素将无法激活鲎试剂的酶。供试品中的螯合剂成分会螯合试剂中的二价阳离子（如Mg2+离子），造成抑制常见的螯合剂有：EDTA、柠檬酸钠、肝素钠、喹诺酮类药物等12解决螯合问题1用BET水对供试品在允许的范围内进行稀释2使用含Mg2+或Ca2+离子的稀释剂稀释样品，降低活性螯合剂含量3注意过高的二价阳离子（如Ca2+）浓度可能会带来抑制13高渗透压问题较高浓度的糖或者盐通常会抑制鲎试剂反应，如50%葡萄糖或5%氯化钠溶液。高渗透压的溶液会从鲎试剂吸水，从而使酶失活，造成抑制使用BET水在允许范围内进行稀释可消除干扰14酶、酶抑制剂问题鲎试剂的凝固酶属于一种丝氨酸蛋白酶，供试品中若含有类似的丝氨酸蛋白酶（常见于血液制品）会导致鲎试剂的反应，造成增强一些人血浆制品（如人血白蛋白、静注用IgG等），作为原料的血浆和血清中的丝氨酸蛋白酶抑制剂会抑制LAL凝固酶与内毒素的反应活性，造成抑制通常来说较为简易的一种消除干扰的方法是：使用BET水稀释10倍，然后使用75℃加热10分钟15内毒素聚集问题提纯的内毒素没有自然存在的内毒素稳定，其稳定性没有环境内毒素强内毒素分子的两亲性使其容易自身聚集成团，成为更大的分子，效价也会下降16解决内毒素聚集问题1如果内毒素标准品溶液需要储存，必须验证其储存条件是否会影响其活性2经常旋涡混合含有标准内毒素的溶液17脂质体问题脂多糖的两亲性会使其对一些具有疏水基团的产品具有亲和力（如脂类、磷脂、脂蛋白、大分子量血浆蛋白）。脂多糖与这些特定产品的结合后会使其的大小和形状受到影响，以至于影响活性，使得内毒素试验受到干扰。使用内毒素分散剂稀释样品可以使内毒素从供试品中分离出来，恢复内毒素的活性18内毒素吸附问题一些试验器具会对内毒素有吸附作用首选硼硅酸玻璃，第二聚苯乙烯材料不要用聚丙烯材料，它会加剧内毒素的损耗（吸附）提防塑料包装溶出物带来的干扰19非内毒素反应物（TAL-RM）β-葡聚糖是造成鲎试验结果假阳性的一个已知来源用抗增液复溶鲎试剂可以消除大多数的葡聚糖干扰不同厂家的鲎试剂配方不同，请使用专用的抗增液，不要随意混用20USP关于β-葡聚糖的描述USP的细菌内毒素检查法要求：

“除了内毒素，鲎试剂还与某些β-葡聚糖反应。一些经处理而制备的鲎试剂不会与β-葡聚糖反应，应使用这种鲎试剂检测含葡聚糖的样品”210.1mg/ml葡聚糖（抗增液）不存在干扰0.1mg/ml葡聚糖出现明显的增强22提防洗涤剂（表面活性剂）！需要注意，无论是生产工艺上使用到的洗涤剂（或表面活性剂），还是器具上残留的洗涤剂都会对鲎试验造成干扰高浓度的洗涤剂使鲎试剂的蛋白变性，失去活性某些洗涤剂（如脱氧胆酸钠）会将内毒素分散为脂多糖的单体（约20,000道尔顿），这些单体是无毒性并且不会激活鲎试剂的，但去除洗涤剂（如透析）后，内毒素活性恢复弱的非离子型表面活性剂（如吐温20或吐温80等）和其它阳离子型洗涤剂会分解内毒素的三维结构，使内毒素变成较小分子，从而增加其效价2