(高清版)DB14 3007-2024 化妆品用原料 重组人源化胶原蛋白的鉴定

ICS11.120.20CCSC30IdentificationprocessofrecombinanthumanizedcollagenIDB143007—2024本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由山西锦波生物医药股份有限公司提出。本文件由山西省化妆品标准化技术委员会归口。本文件起草单位：山西锦波生物医药股份有限公司，山西省检验检测中心（山西省标准计量技术研究院）。本文件主要起草人：王建、于玉凤、卢彦宏、孙丹丹、何振瑞、李喜梅、张朝敏、张永健、刘欣。1DB143007—2024化妆品用原料重组人源化胶原蛋白的鉴定本文件适用于化妆品用原料重组人源化胶原蛋白的鉴定。本文件规定了化妆品用原料重组人源化胶原蛋白的鉴定项目、材料和设备、鉴定方法、结果判定2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。YY/T1888-2023重组人源化胶原蛋白中华人民共和国药典（2020年版）3术语和定义YY/T1888-2023界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1肽段覆盖率（氨基酸序列覆盖度）Peptidecoverage肽段覆盖率（氨基酸序列覆盖度）是指检测到的肽段的氨基酸数量占该蛋白质总氨基酸数量的比例。蛋白质经过酶切后，采用LC-MS进行检测，鉴定到的酶切后肽段占理论序列氨基酸数量的比例。3.2末端氨基酸序列Terminalaminoacidsequence末端氨基酸序列是指蛋白质序列中N端和C端的一段序列。4原理选用适宜的蛋白酶对重组人源化胶原蛋白进行酶解，酶解后的肽段采用高效液相色谱-串联质谱仪检测肽段覆盖率和氨基酸序列。依据样品氨基酸序列与人胶原蛋白某亚型序列匹配度判断是否为重组人源化胶原蛋白。5材料和设备5.1试剂和材料a)水：GB/T6682，一级；b)碳酸氢铵：纯度≥99.5%；2DB143007—2024c)盐酸胍：纯度≥99%；d)二硫苏糖醇（DTT）：纯度≥99%；e)碘乙酰胺（IAM）:纯度≥99%；f)甲酸：质谱级；g)乙腈：质谱级；h)超滤管；i)胰蛋白酶（Trypsin）：测序级。注：根据不同蛋白序列选择适合的酶进行酶切，可采用多种酶切综合鉴定，常用的蛋白内切酶还有赖氨酸蛋白酶（Lys-C）、谷氨酰蛋白内切酶（Gl5.2试剂配制5.2.1碳酸氢铵溶液（50mmol/L）：准确称取0.395g碳酸氢铵定容于100mL水中，混匀。5.2.2盐酸胍溶液（6mol/L准确称取28.66g盐酸胍定容于50mL的碳酸氢铵溶液（5.2.1）中，混匀（现用现配）。5.2.3DDT溶液（1mol/L）：准确称取0.154g二硫苏糖醇溶于盐酸胍溶液（5.2.2）中，混匀（现用现配）。5.2.4IAM溶液（1mol/L准确称取0.185gIAM溶于1mL盐酸胍溶液（5.2.2）中，混匀后避光放置（现用现配）。5.2.5Trypsin溶液（0.2μg/μL）：准确称取20μgTrypsin，溶于100μL水中，混匀。5.2.60.1%甲酸水溶液：取1mL甲酸加水定容至1000mL,混匀。5.2.70.1%甲酸乙腈溶液：取500μL甲酸定容于500mL乙腈中，混匀。5.3仪器设备5.3.1高效液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱仪:配有电喷雾离子源（ESI）。5.3.2高速冷冻离心机：转速不低于12000r/min。5.3.3分析天平：感量0.0001g。5.3.4水浴锅：温度均匀度±0.3℃。5.3.5涡旋振荡器。6鉴定方法6.1样品处理1)取100μL重组人源化胶原蛋白溶液(1μg/μL)置于超滤管接收管中，12000r/min离心15min；2)变性：加入100μL盐酸胍溶液（5.2.23)还原：加入2μLDTT溶液（5.2.3涡旋震荡使蛋白均匀分布于溶液中，42℃孵育1h；4)烷基化处理：超滤管接收管中加入5μLIAM溶液（5.2.4涡旋震荡使蛋白均匀分布于溶液中，避光室温放置30min，14000g离心15min；5)置换溶液：接收管中加入100μL碳酸氢铵溶液（5.2.112000r/min离心15min，重复两次；6)酶切：将接收管取出置于新的超滤管中，再加入碳酸氢铵溶液（5.2.1）100μL，0.2Trypsin溶液（5.2.5）15μL，旋涡震荡，使蛋白溶液均匀分布；7)封口膜封好放置于37℃孵育18小时；8)将超滤管倒置离心，收集溶液。3DB143007—20246.2仪器条件6.2.1高效液相色谱参考条件a)色谱柱：C18，150*2.1mm（内径），粒度1.6μm，或相当者；b)流动相A：0.1%甲酸水溶液（5.2.6）；c)流动相B：0.1%甲酸乙腈溶液（5.2.7）；d)流速：0.2mL/min；e)柱温：40℃;f)进样体积：4μL；g)流动相梯度洗脱程序见表1。表1色谱分离梯度021255226.2.2质谱参考条件a)离子源：ESI；b)检测方式：正离子模式；c)MS扫描范围200-2000m/z；d)MS/MS扫描范围50-2500m/z。6.3数据分析产生的原始数据及图谱由数据分析软件识别标峰并导出对应图谱，通过质谱数据和相关质谱鉴定图谱进行数据库匹配，得出肽段覆盖率及末端氨基酸序列鉴定结果（具体示例见附录A中A.1及A.2）。7结果判定样品检测出的氨基酸序列需与理论氨基酸序列一致，肽段覆盖率需达到100%。将氨基酸序列检测结果和人胶原蛋白某亚型序列进行比对，判断样品是否为重组人源化胶原蛋白(具体比对示例见附录A中A.3）。将样品检测出的氨基酸序列与人胶原蛋白某亚型序列进行比对，匹配度100%，为“A型重组人源化胶原蛋白”；匹配度大于等于80%，小于100%，为“B型重组人源化胶原蛋白”；匹配度小于80%，则该样品不属于重组人源化胶原蛋白。0110203040GERGAPGERGPAGPGEBGAPGERGAPGERGPA90100110120..KGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERG170180190200210220230240PAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPA250260270280290300310GERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAG3303403503603703803KGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERG410420430440PAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPA-晋240鲁430440450450470■2b2ybebsb7b40图A.4重组人源化胶原蛋白Lys-C酶解产物C末端肽段二级谱图B20290220冒4604703yybep0p0bibbi0bieb2020002200