乙肝丙肝核酸检测的新平台临床

乙肝丙肝核酸检测的新平台临床目前乙肝和丙肝临床治疗过程中遇到得主要问题治疗终点无法准确判定有些病人经一段时间治疗后DNA/RNA检测结果忽阴忽阳,但临床症状依然明显不能及时预测耐药(病毒学突破)核苷(酸)类似物治疗后病毒DNA/RNA快速下降至检测限以下,不久却发现病毒出现反跳疗效得准确监测？？？治疗后12或24周病毒DNA/RNA下降幅度直接决定预后问题得根源在哪里？内容HBV核酸检测得现状与需要HCV核酸检测得现状与需要罗氏得CAP/CTM能带来什么益处总结HBVDNA监测在抗病毒治疗中得临床应用HBVDNA就是监测抗病毒治疗响应和时间得关键标志物HBV治疗得路线图理念,为HBVDNA监测用于临床实践提供了指导对用药耐药性得监测(拉米夫定－YMDD,…)肝移植HBV复发风险得降低(术前,术后)……HBVDNA监测得临床应用HBV治疗路线图

KeeffeE、ClinGastroHepatology2007;5:890-897、侯金林等,慢性乙型肝炎抗病毒治疗方案优化,中国肝脏病杂志国产试剂现状目前使用得国产试剂能解决得问题,不能解决得问题:HBV试剂盒说明:500～5×107IU/mL较可信得测试范围:104～5×107IU/mL对部分发生HBV病毒突变得病人无法准确检测注:1IU/mL=1copy/mL内容HBV核酸检测得现状与需要HCV核酸检测得现状与需要罗氏得CAP/CTM能带来什么益处总结HCVDNA监测在抗病毒治疗中得临床应用HCV病毒感染就是可治愈得疾病HCVRNA检测可以有效指导临床用药治疗得终点就是核酸检测为阴性(核酸检测可以直接指导停药时机)慢性HCV治疗方案治疗应答名称描述快速病毒学应答(RVR)4周时未检测到HCVRNA早期病毒学应答(EVR)-完全早期病毒学应答(cEVR)未RVR,但12周时未检测到HCVRNA-部分早期病毒学应答(pEVR)未RVR,12周时HCVRNA拷贝数下降≥2log10,但仍检测到HCVRNA没有应答12周时HCVRNA拷贝数下降<2log10治疗结束(EOT)治疗结束未检测到HCVRNA持续病毒学应答(SVR)治疗结束后24周,未检测到HCVRNA反弹治疗期间曾有HCVRNA低于检出限,但尚未停药即出现HCVRNA重新升高复发治疗期间HCVRNA低于检出限,但治疗结束(停药)后HCVRNA重新升高慢性HCV治疗方案用药12周早期病毒学反应HCVRNA下降<2logHCV病毒检测阴性HCV病毒检测阳性停药HCV病毒检测阴性治疗到24周HCVRNA检测HCVRNA下降>2log继续治疗至48周继续治疗至24周考虑停药国产试剂现状目前使用得国产试剂能解决得问题,不能解决得问题:HCV试剂盒说明:500～5×107IU/mL较可信得测试范围:104～5×107IU/mL注:1IU/mL=1copy/mL大家学习辛苦了，还是要坚持继续保持安静内容HBV核酸检测得现状与需要HCV核酸检测得现状与需要罗氏得CAP/CTM能带来什么益处总结全世界第一台用于体外诊断得全自动荧光定量分子诊断系统真正实现“样品进,结果出”全球安装超过2,000台,国内安装超过40台COBASAmpliPrep/COBASTaqMan系统COBASAmpliPrep/COBASTaqMan48®系统COBASAmpliPrep/COBASTaqMan96®系统(带连接系统)COBASAmpliPrep/COBASTaqMan96®系统

(无连接系统)COBASAmpliPrep仪器简介全自动系统,自动进行核酸提取纯化和PCR反应体系配制基于MGP磁珠分离技术,确保高质量得核酸提取纯化最多72个样品可以同时上机,运行中可连续装载上架,提高工作效率包括耗材、样品、试剂均可以连续上样DNA或者RNA1、裂解、稳定和去蛋白2、核酸捕获病毒或细胞3、冲洗4、洗脱37°C孵育COBASAmpliPrep仪器

MGP磁珠分离技术室温80°C孵育取SPU枪头样本管/反应管管盖抓手样本初始体积感应器取试剂钢针CAP机械臂介绍样本管/反应管结构COBAS

TaqMan/COBASTaqMan48分析仪简介检测通量可达4*24测试独立得24孔热循环仪TaqMan48有2个模块,TaqMan96有4个模块最多可同时进行4个不同得分析检测操作简单,核酸扩增和检测全部自动完成实时定量PCR检测技术,卓越得检测性能,灵敏度高和特异性好,动态范围宽HBV-DNA定量测试用于药品FDA注册试验通用名商品名

FDA批准日期关键得HBV-DNA测试Interferonalfa-2bα-2b干扰素

INTRON®A1991N/ALamivudine拉米夫定EPIVIR-HBV®1998杂交研究解决方案

1Adefovirdipivoxil阿德福韦酯HEPSERA™2002AmplicorMonitor2Entecavir恩替卡韦BARACLUDE™2005CobasAmplicor3Peginterferonalfa-2a聚乙二醇干扰素α-2aPEGASYS®2005CobasAmplicor4Telbivudine替比夫定TYZEKA™2006CobasAmplicor5Tenofovir替诺福韦VIREAD(HIV)Phase3CobasTaqMan6

INTRON®A(Interferonalfa-2b)[packageinsert]、Schering-PloughCorp、Kenilworth,NJ2、EPIVIR-HBV®(Lamivudine)[packageinsert]GlaxoSmithKline,ResearchTrianglepark,NC3、HEPSERA™(Adefovirdipivoxil)[packageinsert]GileadSciences、FosterCity,CA4、Pegasys(Peginterferonalfa-2a)[packageinsert]、Hoffmann-LaRocheInc、Nutley,NJ5、TYZEKA™(Telbivudine)[PackageInsert]、NovartisPharmaceuticalsCorp、EHanover,NJ6、MarcellinPetal、HepDART2007MeetingAbstract63,Dec9-132007,Lahaina,HI国外发表得文献Evaluationofinitialvirologicalresponsetoadefoviranddevelopmentofadefovir-resistantmutationsinpatientswithchronichepatitisB、Gallegoetal、,JournalofViralHepatitis,2008,15,392–398Evaluationofanautomated,highlysensitive,real-timePCR-basedassay(COBASAmpliprepTM/COBASTaqManTM)forquantificationofHCVRNA、ChristophSarrazinaetal、,JournalofClinicalVirology,2008,43,162–168COBASAmpliPrep-COBASTaqManHepatitisBVirus(HBV)Test:aNovelAutomatedReal-TimePCRAssayforQuantificationofHBVDNAinPlasma、TizianoAlliceetal、,JournalofClinicalMicrobiology,Mar、2007,p、828–834EvaluationoftheCOBASAmpliPrep-totalnucleicacidsolation-COBASTaqManhepatitisBvirus(HBV)quantitativetestandparisontotheVERSANTHBVDNA3、0assay、RonsinCetal、,JournalofClinicalMicrobiology2006vol、44(no、4)parisonoftheCOBASTaqManTMHBVTestWiththeCOBASAmplicorMonitorTMTestforMeasurementofHepatitisBVirusDNAinSerum、SimonSiu-ManSumetal、,JournalofMedicalVirology2005,77:486–490HepatitisBvirus(HBV)genotypedeterminationbytheCOBASAmpliPrep/COBASTaqManHBVTest,v2、0inserumandplasmamatrices、GoedelSetal、,JournalofClinicalVirology2009Jul;45(3):232-6parisonofVersantHBVDNA3、0andCOBASAmpliPrep-COBASTaqManassaysforhepatitisBDNAquantitation:Possibleclinicalimplications、GARBUGLIAA、R、etal、,Journalofvirologicalmethods2007,vol、146,no1-2,pp、274-280PerformanceoftheCobasAmpliPrep/CobasTaqManReal-TimePCRAssayforHepatitisBVirusDNAQuantification、Ste´phaneChevaliezetal、,JournalofClinical,May2008,p、1716–1723……HBV得定量检测性能指标国产HBV试剂CAP/CTMHBV灵敏度(LOD)500IU/mL？12IU/mL检测范围104～5×107IU/mL54-1、1×108IU/mL定量方法外标法定量内标法定量其她对部分发生HBV病毒突变得病人无法准确检测涵盖亚型:A-G加强pre-core突变检测注:国产试剂1IU/mL=1copy/mLHCV得定量检测性能指标国产HCV试剂CAP/CTMHCV灵敏度(LOD)500IU/mL？15IU/mL检测范围104～5×107IU/mL43–6、9×107IU/mL定量方法外标法定量内标法定量其她未知1-6型(能区分0、5log浓度变化)定量原理

外标法定量(国产试剂)使用一组(4管)外部标准品定量,分别为5×104到5×107IU/mL未考虑各患者血液成分间得差异性对结果得影响定量原理

内标定量InternalQuantitationStandard(CAP/CTM)内标就是已知拷贝数得人工构建核酸,加入每一反应管,与靶核酸竞争扩增,管内定量可提示反应就是否存在反应抑制,避免假阴性结果充分考虑管间反应效率得差异,得到可靠精确得结果COBASA