分子诊断技术在病原微生物检测中的应用

分子诊断技术在病原微生物检测中的应用微生物包括细菌、病毒、衣原体、支原体、立克次体、螺旋体、放线菌和真菌以及一些小型的原生生物等在内的一大类生物群体，它们个体微小、种类繁多、与人类关系密切，广泛用于食品、医药、工农业生产、环保等诸多领域。从医疗领域的角度来看，通过积极做好对于病原微生物的科学检测，医疗人员可以依据检测结果有效实现对于疾病的诊疗工作，这对人民群众身体健康的保障具有良好的促进作用。一、高通量测序高通量测序技术又称“下一代”测序技术，以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。高通量测序主要分为第二代边合成边测序、第三代单分子测序以及第四代纳米孔测序等三类。在临床领域中该技术具有较为明显的技术应用优势。对于结核病患者而言，由于结核杆菌痰涂片菌阳率低而痰培养耗时又长并且临床用药后影响检出，严重影响了结核的诊断和治疗，而高通量测序技术的应用可以实现结核的早期诊断，对于患者后续诊疗工作具有良好的促进作用。与此同时研究表明，该技术的合理应用有利于帮助医疗卫生部门合理实现对于流行性疾病暴发的科学防控。高通量测序技术的应用对于操作仪器设备和操作人员的专业能力与实践经验都具有较高的要求，相信在未来应用会越来越广泛。二、核酸适配体技术核酸适配体是一段寡核苷酸序列（DNA或RNA）。通常是利用体外筛选技术——指数富集的配体系统进化技术，从核酸分子文库中得到的寡核苷酸片段。作为病原微生物检测过程中的重要技术。核酸适配体技术在临床工作中的应用较为广泛。核酸适配体技术主要通过技术手段对于样本中的蛋白、酶、以及小分子物质等寡核酸片段进行获取。该技术的应用包括扩增、调节以及分离、结合以及洗脱等五个环节。在此过程中，作为重要的组成环节之一，分离环节可以有效实现对于适配体靶分子的合理筛选。鉴于适配体的亲和力较强且修饰难度偏低，因此，其可以在特定蛋白的适配体中进行大面积应用。该技术在临床过程中展现出广阔的应用前景，在未来该技术有望取代抗体检测技术。从现有研究的角度分析，近年来基因治疗与特异性传递系统的发展均为该技术的蓬勃发展提供了强有力的保障。三、数字PCR技术数字PCR即（dPCR)，它是一种核酸分子绝对定量技术。相较于qPCR，数字PCR可让你能够直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量。该技术主要借助了微球乳糜液化作用进行检测。通过将乳糜液在芯片微孔中进行分散，有利于确保每个芯片微孔中都存在一个核酸模板，结合相应的染料与试剂后微孔所释放的光信号进行捕获和检测。研究人员表示，通过相关检测工作的全面落实，实现对靶核酸模板的检出。在检测期间通过对两种信号的比例与数目进行统计，检测人员可以得到明确的绝对定量。实践表明该技术的优势在于其摆脱了定量PCR在检测期间必须依靠标准曲线的问题，且降低了对于模板Ct值的依赖性。就目前而言，该技术凭借自身优势在临床检测过程中得到了广泛的应用，例如:在对巨细胞病毒、口腔病毒以及牛丘性疹性口炎病毒的检测等。四、基因芯片技术基因芯片技术是同时将大量的探针分子固定到固相支持物上，借助核酸分子杂交配对的特性对DNA样品的序列信息进行高效的解读和分析，基因芯片技术主要从核酸分子杂交这一技术理论发展而来。在临床过程中，基因芯片可以通过特殊的形式将核酸探针分子排列至经过处理的硝酸纤维素膜表面。在此过程中，以光导原位合成法的应用较为广泛。排列完成后，可以使用计算机软件对于样品的信号进行判断并依据其所发出的信号强弱对样品中是否存在病原微生物进行判断。（五）随机扩增多态性DNA技术RAPD技术建立于PCR技术基础上，在对病原微生物进行检验的过程中，RAPD可以在基因组DNA区域中有效实现对于PCR的扩增。但是，在应用该物质的过程中需要特别注意，其对于温度有着严格的要求，需要处于低复性温度下。为了有效实现对于检测期间菌株基因组DNA特点的熟悉，相关检测人员需要合理做好对于脉冲场凝胶电泳的妥善应用。实践表明通过相关技术的合理应用，有利于检测人员有效实现多态性检测工作的开展，对于菌株分子分型鉴定具有良好的促进作用。不过，在检测期间，其对于相关对象的聚合酶类型指标的要求相对较高。（六）DNA传感器技术DNA传感器器以DNA为敏感元件，通过换能器将DNA与DNA、DNA与RNA与DNA与其它有机无机离子之间的作用的生物学信号转变为可检测的光、电、声波等物理信号。近年来，DNA传感器在基因诊断、环境监控、药物研究等领域的应用研究受到广泛重视。应用该技术对病原微生物进行检测的过程中，检测人员往往需要在传感器中置入一条单链DNA，随后检测人员可以使用相关传感器上的单链DNA与互补单链DNA进行杂交的方式对于样本的病原微生物进行检测。在这一检测过程中，相关人员需要对于检测信号进行关注。（七）核酸等温扩增技术目前在临床和现场病原微生物快速检测中具有良好发展前景的核酸等温扩增技术是环介导等温扩增(LAMP)。LAMP是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶在等温条件保温30~60min，完成核酸扩增反应，产物利用荧光或浊度检测进行定量分析。该技术不依赖专门仪器，不需要热循环，扩增产物可通过肉眼或浊度计判断，灵敏度和特异性均优于常规PCR，成本远低于定量PCR，但靶序列最好控制在300bp以内，同时由于该技术灵敏度高，极易被污染而造成高假阳性等问题。目前，LAMP技术在丙型肝炎病毒、乙脑病毒、甲型流感病毒和腮腺炎病毒，以及细菌、支原体等检测领域已得到广泛应用。（八）多重PCR技术在常规PCR基础上通过增加引物对数，衍生出多重PCR技术。常规PCR仅采用一对引物，而多重PCR则可在同一个反应体系中扩增多个目的基因。多重PCR主要用于多种病原微生物的同时检测或鉴定，也广泛应用于某些遗传病及癌基因的分型鉴定，如肝炎病毒、肠道致病性细菌、性病、战伤细菌及生物战剂细菌和需特殊培养的无芽孢厌氧菌检测等。（九）定量PCR技术该技术利用荧光染料或荧光探针，对扩增过程中荧光信号进行实时监测，通过标准曲线准确定量样品初始DNA拷贝数。该技术的核酸扩增和检测在同一体系中进行，避免了开盖检测造成的污染；产物无需电泳，特异性好、灵敏度和自动化程度高；具有可与生物芯片或免疫磁珠等技术联用等优势。定量PCR技术已成为临床病原微生物检测的常规手段之一，广泛用于乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒和流感病毒等检测，但如何进一步加强该技术的质量监管体系建设、减少或抑制操作过程中的干扰因素等，是摆在其面前的主要挑战。该技术主要分为双链掺入法、Taqman探针、分子信标和双杂交探针等。随着分子诊断技术的合理应用与普及，我国医学领域对病原微生物的检测综合水平得到了显著