奶绵羊胚胎冷冻技术规程

1奶绵羊胚胎冷冻技术规程本标准规定了奶绵羊体内胚胎形态鉴定与程序化冷冻技术要点。本标准适用于奶绵羊的体内胚胎程序化冷冻保存。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T1571-2007羊胚胎移植技术规程NY/T1674-2008牛羊胚胎质量检测技术规程3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1奶绵羊dairysheep指以产奶为主要生产方向的绵羊品种。3.2胚胎冷冻embryofrozen将胚胎和冷冻液装入冷冻管中，经过一定的降温方式将胚胎保存于-192℃~-196℃的环境中，使其代谢和发育处于暂时停顿状态、温度恢复后仍能正常发育的一种保存方法。3.3植冰seeding又称诱发结晶，溶液在温度达到冰点时不结冰，待降到冰点以下一定温度才结冰，这种现象叫做超冷现象。植冰是指在略低于溶液冰点的温度下通过加入冰母或强行冷却的方式诱导溶液结冰，以防止超冷现象的出现，阻止核冰晶的自动形成。3.4胚胎解冻embryothawing是指将保存在液氮中的冷冻胚胎在应用前进行解冻处理，把冷冻保护剂逐步置换出来，恢复胚胎的活力。24胚胎形态鉴定供体羊发情后D5.5～6.5体内生产的胚胎按《羊胚胎移植技术规程》（NY/T1571-2007）使用体式显微镜进行形态学鉴定，形态示意图见附录A。5胚胎冷冻保存5.1胚胎冷冻所需器材体视显微镜、胚胎冷冻仪、液氮灌、胚胎吸管、0.25mL塑料冷冻麦管、麦管塞、装管器、玻璃细管、0.22μm针头式细菌滤器、培养皿（35mm）、记号笔、标签纸。5.2胚胎冷冻所需溶液保存液：含0.4%牛血清白蛋白（w/v）的PBS液。冷冻液Ⅰ：含1.5M乙二醇的保存液。冷冻液Ⅱ：含10%甘油（v/v）的保存液。冷冻液Ⅲ：含6%甘油（v/v）的保存液。冷冻液Ⅳ：含3%甘油的（v/v）保存液。解冻液Ⅰ：含0.25M蔗糖的保存液。解冻液Ⅱ：含1M蔗糖的保存液。解冻液Ⅲ：含0.3M蔗糖+3%甘油（v/v）的保存液。解冻液Ⅳ：含0.3M蔗糖+6%甘油（v/v）的保存液。5.3胚胎操作室要求温度在20℃~25℃之间，操作前使用不低于1.5W/m的紫外灯消毒20min～30min，工作区用70%酒精擦拭消毒。5.4胚胎选择根据形态选择发育期为早期桑椹胚（EM）、紧缩桑椹胚（CM）、早期囊胚（EB）、囊胚（BL）和扩张囊胚期（EXB）的A、B（1、2）级胚胎（附录A图A.2、A.3）进行冷冻。5.5胚胎的洗涤与平衡5.5.1乙二醇冷冻液冷冻胚胎的洗涤与平衡胚胎冷冻前在保存液洗涤5次～6次；洗涤后的胚胎放入冷冻液Ⅰ中，室温下平衡15min～20min。5.5.2甘油冷冻液一步法胚胎冷冻的洗涤与平衡胚胎冷冻前在保存液洗涤5次～6次；洗涤后的胚胎放入冷冻液Ⅱ中，室温下平衡15min～20min。5.5.3甘油冷冻液三步法胚胎冷冻的洗涤与平衡胚胎冷冻前在保存液洗涤5次～6次；洗涤后的胚胎依次放入冷冻液Ⅳ、Ⅲ和Ⅱ中，每种冷冻液中室温下平衡4min～5min。35.6胚胎装管将胚胎按五段法装入冷冻麦管，装管顺序：冷冻液（1.0cm～1.5cm）-气泡（0.2cm～0.4cm）-冷冻液（1.5cm～2.0cm）-气泡（0.2cm～0.4cm）-冷冻液加胚胎（2.0cm～3.0cm）-气泡（0.2cm～0.4cm）-冷冻液（1.5cm～2.0cm）-气泡（0.2cm～0.4cm）-冷冻液（1.0cm～1.5cm），示意图见附录B，每支装1枚～10枚相同发育期、相同级别胚胎。5.7胚胎记录在标签纸上打印记录胚胎信息，包括胚胎的母本品种、母本耳号、父本品种、父本耳号、数量、发育期、质量以及冷冻日期，粘贴于麦管上。数量、发育期、质量标注方式为XEM/CM/EB/BL/EXB1/2，其中X表示数量，EM/CM/EB/BL/EXB表示发育期，下标1/2表示A/B级胚胎级别。如2CM1代表2枚A级紧缩桑椹胚，2CM2代表2枚B级紧缩桑椹胚。5.8冷冻程序5.8.1乙二醇冷冻液冷冻胚胎程序胚胎冷冻麦管由室温直接置入-6.0℃的程控冷冻仪，平衡4min～5min后，在-6.0℃时植冰1s～3s，继续平衡5min，然后以-0.3～-0.5℃/min的速率降温至-35℃,平衡10min，取出胚胎冷冻麦管，直接投入液氮中临时保存。同时在标签与记录本上详细记录胚胎信息，胚胎冷冻信息登记表见附录C表C.1。5.8.2甘油冷冻液冷冻胚胎程序胚胎冷冻麦管由室温直接置入-6.5℃的程控冷冻仪，平衡4min～5min后，在-6.5℃时植冰1s～3s，继续平衡5min，然后以-0.3℃/min～-0.5℃/min的速率降温至-35℃,平衡10min，取出胚胎冷冻麦管，直接投入液氮中临时保存。同时在标签与记录本上详细记录胚胎信息，冷冻胚胎信息登记表见附录C表C.1。5.9冷冻胚胎贮存根据冷冻胚胎信息放入液氮罐中的相应位置，及时补充液氮。5.10胚胎解冻5.10.1一步法解冻程序解冻时，从罐中取出细管在空气中停留10s～15s后，浸入28℃~32℃水浴中20s，然后将胚胎冷冻麦管用灭菌吸水纸擦干，用70%酒精棉球擦拭麦管，晾干15s～20s，拔去细管塞，把胚胎推出，乙二醇冷冻液冷冻胚胎置入解冻液Ⅰ中、甘油冷冻液冷冻胚胎置入解冻液Ⅱ中平衡4min～5min，然后在保存液中洗5次～6次，镜检备用。同时在记录本上详细记录胚胎信息，解冻胚胎信息登记表见附录C表C.2。5.10.2三步法解冻程序解冻时，从罐中取出细管在空气中停留10s～15s后，浸入25℃~32℃水浴中20s，然后将胚胎冷冻麦管用灭菌吸水纸擦干，用70%酒精棉球擦拭麦管，晾干15s～20s，拔去细管塞，把胚胎推出后，依次置入解冻液Ⅳ、Ⅲ和Ⅱ中平衡4min～5min，然后在保存液中洗5次～6次，镜检备用。同时在记录本上详细记录胚胎信息，解冻胚胎信息登记表见附录C表C.2。45.11胚胎复苏检测胚胎解冻后，使用体式显微镜观察，解冻后的胚胎发育阶段和质量按《牛羊胚胎质量检测技术规程》（NY/T1674-2008）进行。胚胎解冻信息登记表见附录C表C.2。5（资料性附录）不同级别胚胎形态图图A.1不同发育阶段早期胚胎D：囊胚（blastocyst，BL）；E：扩张囊胚（expandedblastoc图A.2A级胚胎）；）；图A.3B级胚胎注：A：桑椹胚（morula，M）；B：紧缩桑椹胚（compac图A.4C级和D级胚胎注：A：C级桑椹胚（morul