绵羊体外胚胎生产技术规程

1绵羊体外胚胎生产技术规程本文件规定了绵羊体外胚胎生产过程中的体外成熟、体外受精和早期胚胎体外培养、胚胎移植等内本文件适用于绵羊体外胚胎生产程序。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T1234牛冷冻精液生产技术规程NY/T1571羊胚胎移植技术规程3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。体外成熟Invitromaturation卵母细胞在体外恢复减数分裂并发育到第二次减数分裂中期（MII）这一过程，经历核成熟和细胞质成熟。3.2体外受精Invitrofertilization哺乳动物的精子和卵子置于适宜的培养条件下使之完成受精的一种技术。3.3胚胎移植EmbryoTransfer将体外或体内生产的优质胚胎移植给另外一个同种、生理状态相同的受体动物体内，使之继续妊娠发育为新个体的技术。4器皿清洗和消毒器皿的清洗和消毒方法参照NY/T1234执行。25体外胚胎生产培养液配制体外成熟培养液、抽卵液、洗卵液、受精液（IVF液）和胚胎发育液（IVC液）配方见附录A。6操作前准备实验室和超净工作台紫外灯，照射20min后用酒精擦拭消毒；待关闭实验室紫外灯30min后，操作人员将双手清洗干净后，更换拖鞋进入实验室，并随手关闭实验室门；穿戴工作服、口罩、手套、帽子等；用75%酒精喷洒消毒双手；工作台和加热台消毒灭菌：实验室工作台，显微镜以及加热台面用酒精擦拭消毒，并且将加热台打开预热。7卵母细胞体外成熟7.1准备工作7.1.1拉制拣卵针点燃酒精灯，拉制多根适宜的捡卵针，口径大于卵丘卵母细胞复合体，管口在火焰上烧圆钝，并使用酒精灯火焰灭菌。7.1.2制作成熟液滴实验开始前制作卵母细胞成熟液滴（100µl成熟液滴，覆盖3.5mL矿物油并放入二氧化碳培养箱内平衡2h以上；采卵液于37℃恒温板上提前预热。7.2检卵将采集后的卵母细胞迅速送回实验室，操作人员将其推入60mm平皿，平皿底部画线，在体式显微镜下依横线从左到右、从上到下的顺序仔细挑选卵，将捡出的卵母细胞放置于盛有采卵液的30mm平皿。将捡卵皿顺时针方向晃动，集中皿中的卵子，待捡出全部的卵母细胞后，依次将皿摆放恒温板上，统一复检；将挑选出的卵母细胞依次使用采卵液、平衡后的成熟液洗涤3次。8体外成熟将洗涤好的卵母细胞，按15/20枚/100µl液滴的密度，移入成熟液滴中，后放入二氧化碳培养箱培养22h～24h；记录成熟时间、成熟培养的卵母细胞数量。培养条件为5%CO2、95%空气、38.6℃、饱和湿度。8.1记录记录抽卵时间、供体羊耳号、供体羊数、品种、抽卵人员、卵泡数、回收卵总数、可用卵数（根据卵丘卵母细胞复合体形态，将其分为A、B、C级）、退化卵数（胞质不均匀、卵丘扩散严重）、裸卵数。9卵母细胞体外受精9.1准备工作3体外受精实验开始前，在二氧化碳培养箱内，平衡受精液（IVF液）2h～3h；37℃预热0.2%的透明质酸酶工作液。9.2准备体外受精精液9.2.1精液选择根据前期试验结果，选择体外受精效果较好的公羊号和相同生产批次的精液，并根据体外成熟卵母细胞的数量计算所需的冻精数量。9.2.2解冻精液从液氮中找到所需精液，置于37℃水浴锅内解冻1min后将细管取出，用纱布将冻精细管外部水分擦干。剪去冻精细管封口端，紧贴离心管壁，再将带有棉塞的另一端剪掉，待精液自动流入离心管后，轻弹冻精细管，使剩余精液流出，用移液枪轻吹混匀。9.2.3检查精子活力取约3µl精液置于载玻片上，盖上盖玻片后，观察精子活力（视野内直线运动精子数量占总精子数比例）和密度，再综合前期相同个体冻精的受精数据，使用精子上游法预估上游后获得的精子数量（未曾使用过的新批次精液，必须做预实验，且受精效果较好，才能用于后续生产。）9.2.4上游精液将试管架置于37℃加热台上，移液枪吸取约100µl精液，缓慢注入装有500µl受精液的试管底部，后置于37℃、5%CO2培养箱内上游30min。9.3处理卵母细胞将体外成熟培养22h～24h的卵母细胞取出，并观察卵母细胞成熟情况，记录卵丘细胞扩展情况；用移卵针将全部卵母细胞移入预热的0.2%透明质酸酶液滴中，轻吹直至剩余2-3层卵丘细胞，后依次使用抽卵液、受精液洗涤3次。将洗涤后的卵母细胞按50～60枚/100µl受精液（四孔板）或15～20枚/100µl受精液的密度移入受精液中。9.4体外受精将上游30min后的精液从培养箱中取出，用移液枪，沿试管壁从每管上游液中吸取200～300µl上清液加入提前预热好的离心管中，1500rpm离心4min后弃掉上清液，剩余约30～50µl精子沉淀（每个精子上游试管），将精子沉淀轻轻混匀。用移液枪吸取精子沉淀，倾斜枪头从边缘插入受精液滴或孔，对准卵母细胞后吹出精液，使其吹散而不结团（每换液滴必须更换枪头），后置于37℃、5%CO2培养箱内孵育20h。10体外培养预先将绵羊胚胎体外发育液（IVC液）在37℃、5%CO2培养箱中平衡2h以上。将体外受精20h~22h的卵母细胞取出置于IVC液内，移液枪轻吹以去除黏附的精子及全部卵丘细胞，使用IVC液洗涤3次并对受精卵进行选择（淘汰胞质不均匀、胞质发黑及死卵之后按50～60枚/500µlIVC液（四孔板）或15～20枚/100µlIVC液的密度移入IVC液中培养。培养条件为：90%N2、5%O2、5%CO2、38.6℃、饱和湿度。410.1观察胚胎发育情况受精后第48h统计卵裂率（卵裂的个数/总卵母细胞数）；受精后第168h统计囊胚率（囊胚的个数/卵裂的个数）并对囊胚进行评分。11胚胎移植胚胎移植方法参照NY/T1571进行。5附录A体外胚胎生产培养液配制A.1卵母细胞体外成熟液配制0.02IU/mLFSH、0.02IU/mLLH、1µg/mLE2、0.1mmol/L半胱胺、1mLFBS、0.1ml青链霉素合剂，使用TCM-199培养基定容至10mL，混匀后用Millipore0.22µm的过滤器过滤，在0℃~5℃条件下可保存2周。A.2抽卵液配制0.05gBSA、0.035g肝素钠、0.5mL青链霉素合剂，使用PBS定容至50mL，混匀后用Millipore0.22µm的过滤器过滤，在0℃~5℃条件下可保存2周。A.3SOF液配制3.1452gNaCl、0.2675gKCl、0.0814gKH2PO4、0.0442gMgSO4、0.2655g丙酮酸钠、1.3115gCaCl2、0.0251g肌醇、0.0074g谷氨酰胺、300µL乳酸钠、0.5mL青链霉素合剂、1%酚红，使用胚胎水定容至50mL，混匀后用Millipore0.22µm的过滤器过滤，在0℃~5℃条件下可保存2周。A.4受精液(IVF液)配制1mL发情羊血清、6IU/ml肝素钠,使用SOF液定容至50mL，混匀后