线性评价评价试验详解

线性评价及分析测量范围的确定09:37:251参考材料•

NCCLS

EP6-A2

：Evaluation

of

Linearity

of

Quantitative

Analytical

Methods;Approved

Guide-Second

Edition•

《临床检验方法确认与性能验证》P153•

WS/T

408-2012

《临床化学设备线性评价指南》09:37:25209:37:25

关于“确认”

(Validation)

方法学研究或方法产品性能研究

由方法建立者或产品生产者完成

给出主要方法性能：

―准确度(accuracy)

―精密度(precision)

―特异性(specificity)

―检测限和定量限(LOD

and

LOQ,

"灵敏度")

―线性(linearity)

―耐变性(robustness)

...

...

3---陈文祥09:37:25

关于验证

(Verification)

对主要方法性能的证实

在引入新方法时进行

对配套系统，一般验证下列指标：

―准确度(accuracy)

―精密度(precision)

―可报范围(reportable

range)

―参考区间(reference

interval)

对非配套系统，验证更为广泛，除上述指标外：

―分析特异性

―分析灵敏度

―任何其他必要指标

[The

U.S.

CLIA]

4---陈文祥概念•

线性范围（Linear

Range)是指系统最终的输出值（浓度或活性）与被

分析物的浓度成正比的范围，此时的非线性误差应低于允许误差。•

分析测量范围（Analytical

Measurement

Range）方法直接测量标

本，而不需要任何的稀释、浓缩或者其它预处理等过程下，测量结果

总误差符合要求的分析物浓度的范围。（CAP）

符合方法学性能，测量总误差满足方法规定的性能指标。•

临床可报告范围（Clinically

Reportable

Range)是方法可采用对标

本的稀释、浓缩或者其他预处理用于扩展直接分析测量下的分析物值

的范围。

临床有用性•

可报告范围（Reportable

Range）：实验室可建立或验证仪器或检测

系统测量相应的准确实验结果值的范围。（CLIA）09:37:255测量区间（Measuring

Interval）•

也称（分析）测量范围。•

测量程序可给出测量结果（数值）、由测量低限和测量高

限构成的闭区间；•

在此区间内，测量总误差满足方法规定的性能指标。•

规定条件下，满足特定的不确定要求时，某一测量仪器

（系统）测量同样的量所给出的一系列数值。•

相关性能获得确认的体外诊断设备的线性曾被称作“可报

告范围”测量范围（measuing

range）:当测量系统的误差处于规定的界限内（如CV=10%)时，被测量值分布的高、低界限值间的范围。09:37:25609:37:257思考•

定量免疫（如化学发光，免疫比浊），校准曲线并非直

线，能否进行线性评价？

1.6

1.4

1.2

1

0.8

0.6

0.4

0.2

00123456线性评价-EP6•

设备熟悉期：在控、校准、样本准备等；•

注意生物安全防护；•

样本（浓度水平）数量：

验证：4-6个样本，覆盖线性范围，3-4次测定；

建立（

Establishment）：9-11个样本，超出20-30%预期

线性范围，3-4次测定。09:37:258•

样本类型：混合病人样本、用适当稀释液稀释的临床样

本、加入分析物的混合临床样本、商品质控物或校准物、

水溶液等。避免干扰，尽量减少基质效应。高浓度样本可

用说明书指定稀释液稀释成系列低浓度样本。•

总体要求：为避免基质效应对结果的影响，进行线性评价

时所选用的样品应与临床实验样品相似，但不应对测定方

法有明确的干扰作用，避免溶血、脂血、黄疸等。•

评价的是理论值（实际浓度、相对浓度）与仪器给出的最

终结果（而非仪器内部的响应值）之间的线性关系。09:37:25909:37:25可添加分析物1009:37:25使用高低混合血清制备系列样本采用足量的混合血清样本时，准备如下：•

X1:

低浓度混合血清，浓度接近或等于下限；•

X5:

高浓度混合血清，浓度等于或接近上限；•

X2:

3份X1

+

1份X5•

X3:

2份X1

+

2份X5•

X4:

1份X1

+

3份X511浓度计算•

如果高/低浓度混合血清的值未知，可将每种混合血清编

码。编码可代表每个血清的相对浓度。对于等浓度间隔样

品，编码可用整数（如1、2、3、4与5）代表连续样品。本

实验方案不需预先知道样品浓度，在确定线性范围时可使

用样品测定结果的均值。09:37:2512样品号1234567891011低浓度混合血清(ml)5.004.504.003.503.002.502.001.501.000.500.00高浓度混合血清(ml)0.000.501.001.502.002.503.003.504.004.505.0009:37:2513如所制备的中间浓度样品不是等间隔，其浓度间隔间的关系应明确，在测定时可以这些间隔间的相对比值做为X值。

实验程序•

一般要求：实验人员必须熟练掌握仪器操作和维护程序、

样本准备方法和校准。•

全部实验和数据采集宜在同一试验批（run）内或者相隔简

短的实验批中完成（最后在一天内完成）。样本随机排

列。有显著携带污染时，应用空白隔开样本。每个浓度样

本重复测定3-4次。记录分析结果。09:37:2514样本浓度测定次数及结果X1Y1-1Y1-2Y1-3Y1-4X2Y2-1Y2-2Y2-3Y2-4X3Y3-1Y3-2Y3-3Y3-4X4Y4-1Y4-2Y4-3Y4-4X5Y5-1Y5-2Y5-3Y5-409:37:25

实验记录表格15检查离群点Dixon

方法•

将每个浓度4次按从大到小排列（Yi-1到Yi-4)

计算极差

D

=

Yi-1

–Yi-4

计算

D1=

(Yi-1-Yi-2)/D

计算

D4=

(Yi-3-Yi-4)/D

D1或D4如果大于0.765（0.05)或0.889（0.01）则该点

为离群点；09:37:2516

x

s

=09:37:2517x

=x1

x2

x3

3格拉布斯（Grubbs）法每组数据中有3个测定结果，分别记为

x1，x2，x3。1)将3个测定值按大小顺序排列,最大值记为

xmax,最小值记为xmin;2)由3个测定值计算均值x和标准差s:32

3i1i

x09:37:2518样品测定次显著性水平α数

3

40.0501.1531.4630.0251.1551.4810.0101.1551.4920.0051.1551.4963)根据可疑值

xmax或

xmin分别按下式计算统计量t：

t1

=

xmax

x

s

x

xmin

s5)如t值大于临界值，则相应的可疑值为离群值。

Grubbs检验临界值表多项回归分析•

将上述数据进行多项回归分析，得出一级、二级与三级多

项式，此步可采用统计学软件（如SPSS,SAS）完成。阶数一级多项式

回归自由度（Rdf）Y

=

a

+

b1X

2二级三级Y

=

a

+

b1X

+

b2X2Y

=

a

+

b1X

+

b2X2

+

b3X33409:37:2519回归方程的线性检验•

t

=

bi/

SEi•

如三级多项式L=

5，R

=

2，Rdf

=

4，df

=

5*2-4

=

6。在t值

表中寻找t界值（双边检验，α=0.05），如非线性系数无显

著性（p>0.05），则数据组被认为具线性，此时可对数据

组进行精密度检验，精密度符合线性判断要求时，数据分

析结束并得出结论为数据组具有统计学线性或一阶线性。

如任一非线性系数具显著性（p<0.05），数据组则为非线

性。此时应进行临床标准的线性与非线性检验。09:37:2520非线性程度判断----临床标准的线性与非线性检验•

1.计算最优拟合曲线与直线的平均差异值

(Average

deviation

from

linearity,

ADL

)09:37:2521计算公式ADL

=x

100%L:样本数09:37:2522

cp

(x):

最优拟合二阶或三阶方程的拟合值a+bx:

拟合一阶方程的拟合值L2

[p(x)(a

bx)]x

Xc

：

所有测定浓度测量数据的平均值

=

(Y1+Y2+Y3+……+Yn)/n09:37:2523σ

=

n

d

1•

yi:

各个测量值•

p(xi):

最优拟合方程的拟合值•

n:

样本数乘以重复次数(L

x

R)•

d:

最优拟合方程的阶数[y数据的精密度检验1.计算不精密度(σ/

%),

即最优拟合方程的回归标准误(σ)和总平均浓度(

)的百分比率。2.最优拟合方程回归标准误的计算公式

ni1i

p(xi)]2最优拟合方程的阶数不精密度界值的常数（C）一阶或二阶6.3三阶6.509:37:25精密度判断24L

R

C

PctBnd

c样品号重复1重复2重复3重复4平均值一阶拟合值二阶拟合值三阶拟合值10.9000.9000.9000.9000.9000.9140.8960.89823.1003.1003.1003.1003.1003.1033.1113.10935.4005.4005.4005.4005.4005.3705.3875.38747.7007.7007.7007.7007.7007.6967.7067.708510.1010.1010.0010.2010.1010.11710.09910.09809:37:25例125方程的阶数系数符号系数值系数标准误t-检验自由度回归标准误最优拟合方程一阶a0.1960.0160.000y=0.855x+0.196一阶b10.8550.0020.000180.038二阶a0.1660.0220.000二阶b10.8700.0080.000二阶b2-0.0010.0000.083170.035三阶a0.1700.0310.000三阶b10.8650.0240.000三阶b20.0000.0050.953三阶b30.0000.0000.843160.036拟合方程参数09:37:2526精密度判断•

也可通过查表4进行精密度检验，首先计算ADL值，得

ADL=0，最优拟合方程是一阶d=1，在L×R

=

20和σ/

是

0.70%

(约1%)

时，查表4得临界值为5.4%,

且未标注字母

“P”，表明测量数据的精密度好。至此，对数据组的统计

学分析结束，得出结论为此组数据具有统计学标准的线性

或一阶线性。09:37:2527

σ/c%L×R=10L×R=12L×R=14L×R=16L×R=18L×R=2015.55.55.45.45.45.426.16.05.95.85.85.736.66.46.36.36.26.147.16.96.86.76.66.556.67.47.27.17．06.968.27.97.77.57.47.278.7(P)8.4(P)8.17.97.87.68PP8.6(P)8.3(P)8.18．09PPPP8.5(P)8.3(P)>9PPPPPP09:37:2528不精密度和ADL的临界值（PctBnd=5%，d=1或2阶）L

样本数R重复测量的次数σ最优拟合方程的回归标准误

σ/c%L×R=10L×R=12L×R=14L×R=16L×R=18L×R=2015.55.55.45.45.45.426.16.05.95.95.85.836.76.56.46.36.26.247.27.06.96.86.76.657.87.67.47.27.17.068.48.17.97.77.57.479.0(P)8.7(P)8.48.28.07.88PP8.9(P)8.6(P)8.48.29PPPP8.9(P)8.7(P)>9PPPPPP09:37:2529不精密度和ADL的临界值（PctBnd=5%，d=3阶）样品号重复1重复2重复3重复4平均值一阶拟合值二阶拟合值三阶拟合值10.7000.7000.7000.7000.7000.8400.7020.68422.9003.0002.9002.8002.9002.8592.9252.95935.5005.1005.1005.3005.3005.0225.1635.16347.1007.1007.2007.1007.1007.1467.2167.18359.0009.4009.0009.1009.1009.2329.0939.11009:37:25例230方程的阶数系数符号系数值系数标准误t-检验自由度回归标准误最优拟合方程一阶a0.0020.0790.984一阶b10.9530.0130.000180.180二阶a-0.2600.0910.0112y=-0.014X+1.105x-0.260二阶b11.1050.0410.001二阶b2-0.0140.0040.000170.136三阶a-0.3390.1390.026三阶b11.1920.1220.000三阶b2-0.0350.0270.217三阶b30.0010.0020.457160.13809:37:2531

计算最佳拟合回归标准误σ=0.136,

总平均浓度

c

=5.02,

σ/c

=2.71%。由ADL计算公式得ADL=2.32%

最优拟合方程是二阶d=2，在L×R=20和σ/c

=

2.71%

(在2%-3%之间)

时，查表4临界值为5.7%-6.1%没有标注字母“P”，表明测量数据的精密度符合作线性评价的要求。ADL

为

2.32%,

小于临界值5.7%-6.1%，表明数据组具有临床可接受的非线性或二阶线性。方程的阶数系数符号系数值系数标准误t-检验自由度回归标准误最优拟合方程一阶a0.6572.8420.820一阶b11.0960.0520.000186.389y=1.096x+0.657二阶a4.7234.2310.280二阶b10.8070.2320.003二阶b20.0030.0030.218176.279三阶a10.7246.4840.118三阶b10.0540.6630.936三阶b20.0230.0170.184三阶b30.0000.0000.244166.19609:37:25例332测定值09:37:2533100

90

80

70

60

50

40

30

20

10

00123456样品号对数据组做图表明数据非常分散，因此先进行数据组精密度检验，假设一阶方程为最优

拟合方程，计算

σ/c=12.2%，

在

d=1，

L×R

=20

和

σ/c>9%

时，查表

4

显示字母“P”。表明数据组精密度差，不能进行线性评价。09:37:2534

σ/c%L×R=10L×R=12L×R=14L×R=16L×R=18L×R=2015.55.55.45.45.45.426.16.05.95.85.85.736.66.46.36.36.26.147.16.96.86.76.66.556.67.47.27.17．06.968.27.97.77.57.47.278.7(P)8.4(P)8.17.97.87.68PP8.6(P)8.3(P)8.18．09PPPP8.5(P)8.3(P)>9PPPPPP09:37:2535不精密度和ADL的临界值（PctBnd=5%，d=1或2阶）L

样本数R重复测量的次数σ最优拟合方程的回归标准误

线性回归•

以分析物浓度为X轴，测定结果为Y轴，绘制X-Y线性图：Y

=

aX

+

b，目测或进行统计学分析，判断是否符合要求。09:37:2536•

前提：实验室设定cv

2%；非线性误差5%•

直观印象：无明显离群点，重复测定数据间的偏差随浓度增加而增

加。09:37:25举例-lgM37•

D2/2

总和39.05，平均值7.81；平方根2.8，相当于总体的重

复性标准差（SD）；百分差值的SD为

0.9%；•

随机误差0.9%，分析析误差一般小于2%（2SD），但是也

有可能超过(TE=Bias+1.65SD).09:37:253809:37:25回归分析39比较直线方程预期值与最近拟合曲线预期值•

低、中、高浓度测定结果超过5%，结论：非线性。09:37:254009:37:25lgM4109:37:25IgM偏差图4209:37:25Ca4309:37:25Ca4409:37:25Ca-多项式回归45•

偏差超过非线性误差（0.2）；决定舍去第6点，用1-5进行评价。如果1-

5符合要求，则其线性为4.65-15.409:37:25预测值偏差比较4609:37:254709:37:2548•

t0.05,7=2.36509:37:25Ca-舍去第6点，多项式回归49•

偏差小于0.2，在4.65-15.4范围内，符合线性要求。09:37:25预期值比较5009:37:255109:37:2552y

=

1.024x

-

0.011

R²

=

0.999-5201510

5

0051015202509:37:25TC-线性评价

2553ModelSummaryRRSquareAdjustedRSquareStd.ErroroftheEstimate0.9998422530.99968450.99965070.121TheindependentvariableisVAR00002.CoefficientsUnstandardizedCoefficientsStandardizedCoefficientstBStd.ErrorBetaSig.VAR000020.96572190.02758890.940744635.0040310VAR00002**20.00921480.00348540.19328112.64384170.013VAR00002**3-0.00031740.0001122-0.1404258-2.82908840.009(Constant)0.03572190.05523960.64667270.52309:37:25SPSS结果54线性最佳差值%0-0.010.040.05-364.2732.072.112.04-0.08-3.56634.144.244.13-0.10-2.408436.216.366.28-0.08-1.313678.288.488.45-0.04-0.4336910.3510.6110.630.020.20130312.9313.2613.340.080.63519609:37:25最佳拟合曲线和直线回归相比55方法最佳拟合方程|D|（mmol/L)|D|%线性范围上限（mmol/L)A二次0.02~0.190.21%~2.45%12.93B一次--12.93C三次0.02~0.100.20%~3.57%20.69D二次0.01~0.060.06%~0.42%12.93E*一次--20.69F一次--12.93G三次0.02~0.080.27%~3.87%20.6909:37:2556可报告范围的确定•

分析测量范围（Analytical

Measurement

Range）方法直接测

量标本，而不需要任何的稀释、浓缩或者其它预处理等过

程下的分析物值的范围。（CAP）

符合方法学性能，测量总误差满足方法规定的性能指

标。•

临床可报告范围（Clinically

Reportable

Range)是方法可采用

对标本的稀释、浓缩或者其他预处理用于扩展直接分析测

量下的分析物值的范围。

临床有用性

•

可报告范围（Reportable

Range）：实验室可建立或验证仪

器或检测系统测量相应的准确实验结果值的范围。

（CLIA），也被称为线性范围

（Linear

Range）09:37:2557实验内容•

浓度水平：5个（或以上）；•

材料：标准溶液、厂家或者PT机构提供的线性材料；（混

合）患者样本、添加分析物；••••稀释液：水、生理盐水、牛蛋白或者血清白蛋白溶液、低浓度样本、空白血清。制备稀释物的程序：如前述，高低浓度样本比例混合；重复测定次数：3次数据分析：绘图，手工绘制通过所有点的最佳直线，如果不能通过所有点，应首先通过较低浓度点；对于直线不通过的点，估算非线性的系统误差。将系统误差与该浓度的预期随机误差（2s）之和与TEa相比较。09:37:2558指定值测定值均值0051051009510010510020020019520520030031030029030040038039040039050047046048047009:37:25胆固醇举例•

数据

mg/dL59y轴为均值与x轴为指定值的图形09:37:25图形•

y轴为均值与x轴为指定值的图形60指定值均值估计偏差给定CV%S2STE(|bias|+2s)TEa055100100020020003003000400390-1031224-3440500470-3031530-6050线性范围可延伸到400mg/dL09:37:2561P158•

A．X轴标记为0%,

25%,

50%,

75%和100%稀释物。•

B．Y轴标记为基于平均值或试验检测范围的适当水平。•

C．绘制【

(0%，混合物1均值),

(25