基因测序(一代测序和二代测序)-用于临床疑难病原体鉴定

基因测序（一代测序和二代测序）用于临床疑难病原体鉴定一、一代测序序用于临床疑难病原体鉴定（可培养疑难病原体）人口不断老龄化，器官移植和骨髓移植患者增多，免疫抑制剂和抗肿瘤等药物大量使用，侵袭性操作不断增加，细菌真菌严重感染患者不断增加，临床微生物检验的标本量不断增加。部分培养出的细菌或真菌通过传统生化反应、表型方法、自动化鉴定仪器、目前先进的质谱仪，凭借丰富的临床经验，仍然难以准确鉴定。一代测序，一次测序一个基因，片段>1000bp，约30元/样本。我们2010年以来，将一代测序技术应用于临床疑难细菌真菌鉴定，取得较好效果并发表SCI论著1篇。第一部分将结合我们的工作进行介绍。二、二代测序用于临床疑难病原体鉴定（难培养或不可培养病原体）有些病原体难于培养或不可培养，少部分细菌和真菌，大部分病毒、螺旋体、衣原体、寄生虫。二代测序，一次测序多个基因，片段200~500bp，可对各类临床样本直接二代测序，可得到数百万条基因片段，难在测序结果的生物信息学分析，约3000元/样本。一、基因测序用于临床疑难病原体鉴定（可培养疑难病原体，一代测序）（一）难鉴定细菌真菌一代测序方法（二）难鉴定细菌一代测序案例（三）难鉴定真菌一代测序案例（一）难鉴定细菌真菌一代测序方法细菌核糖体基因结构特征16S

rRNA编码基因约1500bp，包含约50个功能域。为细菌分类的金标准，由可变区和保守区组成。保守区为细菌共有，可变区有属或种特异性。真菌核糖体基因结构特征18S

RNA基因、5.8SrDNA、28S

RNA基因较保守，不适合区分不同属种。间隔区ITSl、5.8S

rDNA和间隔区ITS2在不同真菌属及种间表现出较高的差异，目前已用于真菌分类鉴定和分子检测，以ITS2应用最广泛。细菌真菌DNA快速提取TaKaRa公司试剂盒（Lysis

Buffer

forMicroorganism

toDirect

PCR）。试剂盒中裂解缓冲液可以对G-菌、G+菌、酵母菌、霉菌等裂解，释放其基因组DNA，结核杆菌、放线菌、诺卡菌也取得较好效果。粗制模板可直接用于PCR反应，节省时间，但粗制模板可能含有抑制PCR的成分。细菌真菌核糖体基因PCR扩增细菌通用引物序列：ccagcagccgcggtaatacg和atcgg(c/t)taccttgttacgacttc，扩增16S

rRNA基因，片段996bp。真菌通用引物序列：gtgaatcatcgaatctttgaac和tcctccgcttattgatatgc，扩增ITS2基因，片段194bp-494bp。经电泳检测，PCR产物条带亮（产量高），无杂带（纯度高）。提供100μlPCR产物、扩增用引物，送公司测序。公司负责PCR产物纯化及浓缩，双向测序，序列拼接，网上接收测序结果电子版。PCR产物序列blastn分析流程PCR产物由华大基因科技公司等进行商业测序，所得测序结果在GenBank进行blastn。比对细菌的16SrRNA基因，相同性（identity）百分比大于99

可以定义到种的水平，97～99可以定义到属的水平，小于97有可能是一个新种。真菌ITS2序列分析，相同性（identity）百分比大于99可以定义到种的水平。一代测序用于临床疑难病原菌鉴定我们2010年以来，将一代测序技术应用于临床疑难细菌真菌鉴定，取得较好效果并发表SCI论著1篇。国内外首次报道临床感染细菌2种，国内首次报道临床感染细菌10种、真菌2种。（二）难鉴定细菌一代测序案例加强生物安全防护

24烘片机抗酸染色阳性结果需注意国内部分统计数据表明，抗酸染色阳性>80为结核分枝杆菌，需转院到结核病专科医院治疗。约5~20

为非结核分支杆菌，用药与抗痨治疗不同。建议将抗酸染色阳性结果及时与临床医生沟通，对该标本加做结核分枝杆菌荧光定量PCR检测，及时区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌。WHO推荐GeneXpert效果最佳多重荧光定量PCR及熔解曲线法原理。快速全自动检测各类标本中结核杆菌、非典型分枝杆菌、利福平耐药基因。结核分枝杆菌测序图龟分枝杆菌测序图诺卡菌属测序图放线菌测序图放线菌用药治疗生氮二氧化碳嗜纤维菌测序图难鉴定细菌分子诊断案例血液中分离出生痰二氧化碳嗜纤维菌（Capnocytophaga

sputigena），G-球菌，是人类口腔的正常菌群，属于条件致病菌，常通过口腔粘膜进入血液，感染者大多患有血液系统恶性肿瘤或粒细胞减少等疾病。该例败血症患者男性，诊断为地中海贫血，来自小儿科层流病房。根癌农杆菌测序图难鉴定细菌分子诊断案例血液中分离出根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）

，G-杆菌，普遍存在于土壤，生活在植物根的表面，依靠根组织渗透的营养物质生存，能诱发植物产生肿瘤。该例败血症患者20岁，女性，诊断为急性胰腺炎，来自消化内科。有些不同属种的细菌可能有着相同的16S

rRNA基因序列，如布鲁氏菌和人苍白杆菌。增加16S-23S

rRNA

基因间隔区测序：因变异性大可用于16S

rRNA基因不能鉴别的非常接近的不同属种或同一属不同种的鉴定。但有些不同属种仍然不能区分。增加病原菌其他特异基因测序增加病原体其他特异基因测序：检索文献不同病原体选取不同特异基因，如布鲁氏菌表面蛋白omp31基因扩增、测序及序列分析。无菌性标本可直接扩增16S

rRNA基因并测序。也可直接扩增病原体特异基因并测序。增加病原菌其他特异基因测序（三）难鉴定真菌一代测序案例报警阳性血液涂片报警阳性血液涂片报警阳性血液涂片马尔尼菲青霉菌测序图难鉴定真菌分子诊断案例马尔尼菲青霉菌（Penicillium

marneffe），常感染艾滋病患者，本病多见于东南亚。该例败血症患者39岁，男性，艾滋病抗体阳性，以肺炎收治于感染科。黑曲霉菌测序图难鉴定真菌分子诊断案例黑曲霉菌（Aspergillus

niger），标本来源是患者耳部脓液。该例患者25岁，女性，就诊于耳鼻喉门诊，诊断为慢性化脓性中耳炎，国内文献报道耳部感染的主要病原真菌是黑曲霉菌。黄曲霉菌测序图镰孢菌测序图难鉴定真菌分子诊断案例镰孢菌（Fusarium），标本来源是眼部分泌物。该例患者48岁，女性，诊断为角膜炎，来自眼科。我国镰孢菌所引起的真菌性角膜炎占真菌性角膜炎体的近40％。二、基因测序用于临床疑难病原体鉴定（难培养或不可培养病原菌，二代测序）PMseq™病原微生物快速检测是华大基因的产品，是国内第一家产品，基于二代高通量测序平台，通过微生物专用数据库（近7000种病原体）进行比对分析，经过智能化算法获得疑似致病微生物的种属信息，提供全面深入的报告参数辅助临床诊疗决策。1个样品3000元以上。二代测序流程RNA病毒也可建库7000种病原体分析区分致病菌污染菌样本收集保存转运二代测序百万序列可检测病原种类种类数量/种细菌2328真菌199病毒4189寄生虫135分枝杆菌（结核和非结核）83支原体/衣原体41病毒有DNA病毒和RNA病毒之分，如怀疑流感病毒、呼吸道合胞病毒、冠状病毒等RNA病毒，需要注意送检RNA检测流程。华大基因二代测序可检测病原体近7000种可检测病原种类种类数量/种细菌5682真菌812病毒7098寄生虫138分枝杆菌（结核和非结核）94衣原体85支原体96立克次氏体90迅敏康IngeniGen公司二代测序可检测病原体14000多种二代测序适用范围疑难危重感染、长期发热待查、血流感染、脑炎脑膜炎、重症肺炎、腹泻等。常规临床细菌真菌检验无法明确病原体的疑难病例可考虑二代测序。二代测序适用范围血浆、痰液、肺泡灌洗液、脑脊液、粪便、组织块等各类标本，无菌采集标本。尽量避免采集污染，以免分析后得到大量污染病原菌的基因片段。按要求保存标本并尽快送检，尽量减少病原体基因降解。二代测序优势（提高阳性率）华大基因二代测序样本数据初步总结血流感染：从传统血培养阳性率12~15，到高通量测序阳性率30~35。脑炎/脑膜炎：从传统培养法阳性率8~10，到高通量测序阳性率25~30。上述样本主要来自疑难感染病例，故存在选样偏倚，还可能存在假阳性，但仍体现了二代测序的优势。二代测序优势（快速筛查病毒感染）二代测序案例分析新英格兰医学期刊14岁联合免疫缺陷综合征男孩8个月2013年波多黎各旅行回国后入院，脑膜炎住院，发展为脑积水和癫痫状态38项

感染病原检测(6周之内)5种

抗生素先后联用诊断不清、治疗无效、束手无策二代测序案例分析48小时完成脑脊液标本二代测序提示钩端螺旋体感染475条序列，占比0.016%改用青霉素治疗32天男孩痊愈出院二代测序案例分析共得到序列数3,063,784二代测序过程PCR扩增选择性，可丢失大量病原体片段二代测序案例分析区分致病菌与污染菌一代测序验证及分型二代测序案例分析D为高浓度青霉素治疗一周J电镜无病毒E至I病理无分支杆菌无真菌ABC为治疗前核磁共振结果二代测序优势对于疑难感染病例，提供快速精准诊断依据。无偏性病原体广覆盖（细菌，真菌，病毒，寄生虫），可以检测更多临床标本类型，灵敏度高。深入提供病原鉴定分型、耐药基因和毒力因子分析。以序列为基础，可快速发现新发病原体，并进行溯源分类。二代测序存在污染问题测序结果中常常含有多种病原体的基因片段，可能是标本采集、运输中污染，可能是各种试剂中存在污染。如何准确判断引起感染的病原体是难题，一般是滤掉皮肤表面常见正常菌群，增加一代测序重复验证、血清学、病理学、电镜等检查。二代测序存在污染问题也有报道认为即使无菌的脑脊液等标本中也许存在正常菌群，尚需进一步研究。急需建立二代测序在病原体中应用的专