3.2基因工程的基本操作程序第2课时课件-高二下学期生物人教版选择性必修3

第三章第2节基因工程的基本操作程序(第二课时）3、目的基因的获取（2）从基因文库中获取

将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。（了解）基因组文库cDNA文库3、目的基因的获取（2）从基因文库中获取将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。（了解）基因组文库cDNA文库怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢？

根据目的基因的有关信息，例如根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA以及基因翻译产物蛋白质等特性来获取目的基因。3、目的基因的获取（3）利用PCR获取和扩增目的基因（常用方法）从基因文库中获取并扩增目的基因通常采用PCRPCR（polymerasechainreaction）聚合酶链反应聚合酶链式反应

是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。DNA半保留复制。体外（PCR扩增仪/PCR仪）。对目的基因的核苷酸序列进行大量复制。可以在短时间内大量扩增目的基因。原理：操作环境：目的：优点：模拟体内DNA复制过程思考：结合体内DNA复制过程，PCR的进行需要哪些条件？

在能量的驱动下,解旋酶将DNA双螺旋的两条链解开，氢键断裂。CGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATATACGTATACGGCTAGCCGTA3'5'CCGTAGTATACGGCTAGCCGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATATA3'5'ATP解旋酶（1）解旋：目的基因的筛选与获取回顾：体内DNA复制

DNA聚合酶等以解开的每一条母链为模板，以游离的四种脱氧核苷酸为原料，按照碱基互补配对原则，各自合成与母链互补的一条子链。CCGTAGTATACGGCTAGCCGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATATA3'5'ACGCAAGCTAGTCATTATATGCATGATCGAGCTT（2）合成子链：回顾：体内DNA复制CCGTAGTATACGGCTAGCCGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATATA3'5'ACGCAAGCTAGTCATTATATGCATGATCGAGCTTACGCAAGCTAGTCATTADNA聚合酶5'3'TATGCATGATCGAGCTT5'3'ATPATPDNA聚合酶作用下形成磷酸二酯键子链延伸合成的方向？只能从5′－端→3′－端延伸，细胞内有RNA引物结合到模板3′－端引发子链的延伸回顾：体内DNA复制（2）合成子链：CCGTAGTATACGGCTAGCCGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATAA5'ACGCAAGCTAGTCATTATATGCATGATCGAGCTT5'3'TAGCCGTATAGCCGATAT3'5'TTACGCGTATATATA5'3'（3）重新螺旋形成新的DNA分子回顾：体内DNA复制3、目的基因的获取（3）利用PCR获取和扩增目的基因（常用方法）参与的组分

在DNA复制中的作用打开DNA双链提供DNA复制的模板合成DNA子链的原料催化合成DNA子链使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸体内DNA复制所需的基本条件解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶思考：DNA体外复制条件？引物（体外）高温耐高温的DNA聚合酶dATP与ATP在结构上有什么区别？dATP为什么能用作DNA复制的底物？如图所示，ATP结构中的五碳糖为核糖，而dATP结构中的五碳糖为脱氧核糖。ATP转移掉两个磷酸基团后剩下的结构就是腺嘌呤核糖核苷酸，所以ATP是转录的底物；同理，dATP转移掉两个磷酸基团后剩下的结构就是腺嘌呤脱氧核糖核苷酸，所以dATP可以用作DNA复制的底物。在PCR过程中加入的并不是4种脱氧核苷酸，实际加入的是4种dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP）。这些分子都有3个磷酸基团，磷酸基团之间通过特殊的化学键相连。dNTP既可作原料，又能提供能量。3′5′DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有链的3′-端，即子链的延伸方向是5′→3′。由于DNA聚合酶不能将单个的核苷酸链连接成链，因此子链合成需要引物（最初的已有链）。DNA聚合酶3′5′模板链(4)利用PCR获取和扩增目的基因2.目的基因的获取方法一、第一步：目的基因的筛选与获取ATCGAATCGGTT

TACCTTAGCCAADNA聚合酶母链DNA子链DNA引物3′3′5′5′

需要引物原因：DNA复制时，DNA聚合酶不能从头合成子链，只能从3’端延伸DNA链，所以子链延伸的方向都是从5’→3’端引物是一小段能与DNA母链的一小段碱基序列互补配对的短单链核酸。（长度通常为20-30个核苷酸）为DNA聚合酶提供了游离的3’端，使DNA聚合酶从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸。3、类型：①自然引物（细胞内）:RNA(主要）②人工引物（PCR）：DNA单链或RNA1、定义：2、作用：拓展：引物3、目的基因的获取3’5’DNA母链13’5’DNA母链23’5’引物13’5’引物23’5’DNA母链13’5’DNA母链2子链延伸方向5’3’PCR扩增的前提是：

根据一段已知目的基因的核苷酸序列合成引物

（不需要知道整个目的基因的碱基序列）

由于DNA的两条链是反向平行的，用

种引物才能保证DNA的两条链同时被扩增，PCR扩增时至少需要

引物22种微量离心管缓冲液PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行。真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2+。DNA模板四种脱氧核苷酸(dNTP)引物分别与两条模板链结合的2种引物耐高温的DNA聚合酶目的基因的筛选与获取一3、目的基因的获取PCR扩增仪）微量离心管缓冲液离心处理后目的基因的筛选与获取一3、目的基因的获取缓冲液目的基因的筛选与获取一3、目的基因的获取3、目的基因的获取（1）.利用PCR获取和扩增目的基因925075℃3`5`5`3`TaqDNA聚合酶引物1引物2原料模板DNA目的基因3、目的基因的获取905072℃3`5`5`3`（1）.利用PCR获取和扩增目的基因PCR扩增过程：第一轮当温度超过_____以上时，

断裂，双链DNA解聚为两条

。

氢键单链DNA(1)变性：90℃不需要解旋酶思考：变性的温度为何是90℃以上的一个温度范围，而不是95℃？因为变性的温度与氢键的数量有关。当氢键数量越多时，所需温度就越高；反之，当氢键数量越少时，所需温度也就越低。905072℃复性（退火）（1）.利用PCR获取和扩增目的基因3、获取目的基因的方法PCR扩增过程：3`5`5`3`第一轮当温度下降

到左右时，

种引物通过

与两条单链DNA结合。

碱基互补配对50℃两思考2：耐高温的DNA聚合酶结合在引物的3’还是5’端？结合在引物的3’端当温度上升到____左右时，溶液中的4种_________在_______________

的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。

（1）.利用PCR获取和扩增目的基因3、获取目的基因的方法PCR扩增过程：905072℃第一轮3`5`5`3`脱氧核苷酸DNA聚合酶72℃(3)延伸：思考1：为什么温度要上升至72℃？耐高温的905072℃变性（1）利用PCR获取和扩增目的基因3、获取目的基因的方法PCR扩增过程：第一轮结束3`5`5`3`第二轮DNA

个，中-长

个，中-短

个，短-短

个，共消耗引物

个。22002（1）.利用PCR获取和扩增目的基因3、获取目的基因的方法PCR扩增过程：905072℃复性第二轮3`5`5`3`5`3`3`5`（1）.利用PCR获取和扩增目的基因3、获取目的基因的方法PCR扩增过程：905072℃延伸第二轮3`5`5`3`5`3`3`5`第二轮结束DNA

个，中-长

个，中-短

个，短-短

个，共消耗引物

个。422063、获取目的基因的方法905072℃变性第三轮3`5`5`3`5`3`5`3`3`5`3`5`5`3`3`5`3、获取目的基因的方法905072℃复性第三轮3`5`5`3`5`3`5`3`3`5`3`5`5`3`3`5`3、获取目的基因的方法905072℃延伸第三轮3、获取目的基因的方法PCR扩增过程：第三轮结束3`5`5`3`5`3`5`3`3`5`3`5`5`3`3`5`5`3`3`5`5`3`5`3`3`5`5`3`3`5`3`5`DNA

个，中-长

个，中-短

个，短-短

个，共消耗引物

个。8242目的基因14非目的DNA数目目的DNA数目循环次数1234567246810121400282252114非目的DNA数目目的DNA数目循环次数1202403624885102261252714114n2n2n-2n思考：PCR技术获取目的基因时至少要经过几次循环才能从DNA分子中

分离出目的基因？3次1.PCR的结果

由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍。即成

形式扩增（约为

，其中n为扩增循环的次数）。指数2n拓展：假设一个DNA分子扩增n次2、总共需消耗引物1和2共多少个？引物1、2各消耗多少个？2n+1－23、含引物的DNA分子多少个？同时含有两种引物的DNA分子多少个？2n2n－1总结：利用PCR获取和扩增目的基因2n-24、第n代复制，消耗了______个引物2n1、非目的DNA数目:目的DNA数目:2n2n-2n思考：2.PCR技术与DNA复制过程比较PCR技术DNA复制相同点原则原料条件不同点解旋方式场所酶结果碱基互补配对四种脱氧核苷酸模板、能量、酶DNA在高温下变性解旋解旋酶催化体外复制细胞内（主要在细胞核内）耐高温的DNA聚合酶解旋酶、DNA聚合酶短时间内形成大量的DNA片段形成整个DNA分子缓冲液琼脂糖凝胶电泳

DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就叫电泳。思考：如何对产物进行鉴定？思考：复性的过程一定是引物与DNA模板链结合吗？思考：用PCR可以扩增mRNA吗？不能！由于RNA不稳定，需要将RNA反转录为cDNA，然后再进行扩增。单链RNA逆转录酶杂交双链DNA链RNA链核酸酶H单链DNADNA聚合酶双链DNAPCR扩增总结：利用PCR获取和扩增目的基因复性时引物与DNA模板的结合是随机的，也存在解开的两条DNA单链的结合，但两条模板链重新结合的概率较低，原因是：①模板链一般比较长，比引物复杂得多，重新结合的概率较低。②加入引物的量足够多，而模板链数量少，引物与模板之间的碰撞结合机会，远远高于模板互补链之间的碰撞机会。TaqDNA聚合酶的应用

高温解决了打开双链的问题，但是，又导致DNA聚合酶失活的问题，耐高温的TaqDNA聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题，促成了PCR技术的自动化。PCR过程需要的引物不是RNA，而是人工合成的DNA单链，其长度通常为20－30个脱氧核苷酸。PCR和细胞内复制的不同点？缓冲液需要为PCR反应提供的物质？DNA模板，四种脱氧核苷酸，分别与两条模板链相结合的两种引物，TaqDNA聚合酶。关于PCR的几点说明：总结：利用PCR获取和扩增目的基因(2022·天津一中高二期中)下图表示利用PCR技术扩增目的基因的部分过程，其原理与细胞内DNA复制类似。下列叙述错误的是A.耐高温的DNA聚合酶总将游离的脱氧核苷酸连接到3′端B.在第三轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段C.引物之间或引物自身发生碱基互补配对，则不能有效扩增目的基因D.从理论上推测，第三轮循环产物中含有引物A的DNA片段占3/4√

1、聚合酶链式反应（PCR）是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。PCR过程一般经历下述若干次循环：90℃以上使模板DNA解聚为单链→50℃左右下复性（引物与DNA模板链结合）→72℃下引物链延伸（形成新的脱氧核苷酸链）。下列有关PCR反应过程的叙述中，不正确的是A.变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，也可利用解旋酶实现B.复性过程中引物与DNA模板链的结合依靠碱基