DB53T 1276-2024 山药茎尖组织培养种苗繁育技术规程

山药茎尖组织培养种苗繁育技术规程本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定工1 6-BA:6-苄基腺嘌呤(6-Benzylaminopurine)25.1实验室5.2仪器设备高压灭菌锅、分析天平、空调、超净工作台、解剖镜、高速冷冻离心机、PCR仪、电泳仪、超纯水机、接种针、手术刀、培养架、光温监控装置、紫外透射仪等。山药茎尖组织培养种苗快繁常用化学试剂类别和等级见附录A表A.1。病毒检测常用化学试剂见附录6培养基6.1培养基配方6.1.1诱导芽萌发培养基6.1.2继代增殖培养基6.1.3生根培养基MS+6-BA0.5mg/L+NAA1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L。6.1.3生根培养基6.2培养基配制6.2.1诱导芽萌发培养基配制各个成分按6.1.1中的配方量取，加蒸馏水定容，用1mol/L的NaOH或HCl将培养基的pH值调到5.8~6.0后分装到组培瓶中(培养基厚度为1cm)6.2.2继代增殖培养基配制培养基的各个成分按6.1.2中的配方量取，加蒸馏水定容，用1mol/L的NaOH或HCl将培养基的pH值调至5.8～6.0后分装到组培瓶中(培养基厚度为1cm)。6.2.3生根培养基配制培养基的各个成分按6.1.3中的配方量取，加蒸馏水定容，用1mol/L的NaOH或HCl将培养基的pH值调至5.8～6.0后分装到组培瓶中(培养基厚度为1cm)。6.3培养基灭菌将装有培养基的组培瓶放入高压灭菌锅，在温度121℃、压力0.105MPa的条件下保持20min。7茎尖组织培养37.1母体选择选择品种特征典型、表型稳定的植株，并进行标记。7.2繁殖材料的采收保存7.2.1被标记植株藤蔓上的珠芽(俗称零余子或山药蛋)成熟时，采收珠芽。7.2.2或者当植株枯黄，地下块茎充分长大时，采收地下块茎。7.2.3将采收的珠芽或块茎进行2d～4d晾晒后，置于通风、干燥的室内保存。7.3育苗与取材7.3.1当珠芽萌芽时，将珠芽播种于底部有排水孔的托盘或盆里，盖上干净、疏松的基质，保持基质湿润，放在25℃~30℃的条件下培养。7.3.2当块茎萌芽时，把块茎横切成约30g的茎段，晾晒茎段2d~4d,待切口愈合，将茎段放置到底部有排水孔的托盘或盆里，盖上基质，保持基质湿润，放在25℃~30℃的条件下培养。7.3.3待山药苗长至20cm～30cm高时，切取顶部嫩芽。7.4.5内喷雾，紫外线灯灭菌20min,关闭门窗。苦7.4.2实验准备7.4.2.1打开超净工作台紫外线灯灭菌30min。7.4.2.2超净工作台开机过滤空气15min,放入已灭菌的培养基、无菌水、培养皿、镊子、手术刀，以及解剖镜、酒精灯、计时器、记号笔等用具。7.4.2.3解剖镜用75%酒精喷雾，表面擦拭3次～4次。7.4.3材料消毒及剥取茎尖7.4.3.1嫩芽用流动自来水冲洗后，放入消毒好的超净工作台。7.4.3.2外植体用75%酒精浸泡30s,无菌水冲洗3次～5次，0.1%氯化汞溶液消毒5min～7min(或用2%次氯酸钠浸泡15min),再用无菌水冲洗3次～5次，放入已灭菌的培养皿中。7.4.3.3在解剖镜下剥取直径0.3mm~0.5mm,带1个~2个叶原基的茎尖。7.5茎尖接种与转接7.5.1将剥取好的茎尖接种到经过灭菌处理的6.1.1培养基上，迅速用瓶盖密封后于培养架上培养。7.5.2培养期间30d～40d转接一次，将培养的茎尖更换到新鲜的已经灭菌的6.1.1培养基上，直到长成约5cm～7cm高的苗。7.6继代增殖培养在超净工作台上，将7.5步骤得到的苗取出，切成带节茎段，插于灭菌好的6.1.2培养基上，一株苗的茎段培养于同一个瓶内，诱导获得丛生芽。7.7培养环境要求培养室内温度保持在25℃±2℃,光照强度20001x～25001x,光照时间每天12h。411.1待组培苗生根4条～5条，根长3cm～5cm时，开始炼苗。11.4在育苗钵里依次装入灭菌的基质(珍珠岩：秸杆腐殖物=1:1),种植组培苗并浇水。5中文化学名分子式或英文名硝酸钾AR(AR为分析纯试剂)磷酸二氢钾碘化钾乙二胺四乙酸二钠BR99.5%(BR为生物试剂)BR99.5%BR99.5%BR99.5%BR99.5%6-苄基腺嘌呤(6-BA)萘乙酸(NAA)Naphthylaceticacid乙醇(酒精)CP95%(CP为化学纯试剂)6中文化学名分子式或英文名次氯酸钠中文化学名分子式或英文名BR99.5%(BR为生物试剂)乙二胺四乙酸AR(AR为分析纯试剂)聚乙烯吡咯烷酮GR(GR为优级纯试剂)乙醇β-巯基乙醇7(资料性)B.1病毒RNA提取用7.6得到的丛生芽上基本展开的叶片提取病毒RNA,每个丛生芽重复提取5次后，用快速通用RNAb)用液氮提前预冷已灭菌的研钵，将丛生芽迅速在研钵里磨成粉末后放入2mL离心管中，并加入1000μL细胞裂解液后震荡30s;c)在上述离心管中加入300μL的去蛋白液和200L的氯仿，震荡30s;d)将离心管放入离心机内离心10mn(122000rpm/min),取新的1.5ml离心管，将500μL的f)所得混合液体分两次加入离心吸附柱中，每次加入后都用离心机离心1min(12000rpm/min),g)分两次向吸附柱中加入500pL的洗柱液，每次加入后都离心1min(12000rpm/min),并i)再次向吸附柱中加入500μL的去酶液，颠倒混匀，室温离心1min(12000rpm/min),弃j)再次加入500μL的去酶液到吸附柱中，混匀后，室温离心1min(12000rpm/min),弃穿1)将离心吸附柱转移到新的RNase-freel的5mL离心管中。加入30μL～80μLRNA洗脱液，B.2RNA质量电泳检测RNase-free离心管中，用移液枪吹打混匀后42℃孵育10min;b)取一个空的PCR管放置冰上加入第(a)步的反应混合8