《杆状病毒昆虫细胞表达系统概述及案例分享》

杆状病毒-昆虫细胞表达系统概述及案例分享Baculovirus–insect

cell

expression

system,BEVS-IC北京义翘神州科技股份有限公司BEVS-IC的组成与优化1BEVS-IC的应用2案例展示3CONTENT义翘神州BEVS-IC的组成与优化01义翘神州义翘神州杆状病毒：一类具有囊膜包裹的双链环状DNA病毒，以节肢动物为专一性宿主。表达用杆状病毒通常是Autographacalifornicamultiplenucleopolyhedrovirus(AcMNPV)doi:10.1002/cpps.47义翘神州杆状病毒：一类具有囊膜包裹的双链环状DNA病毒，以节肢动物为专一性宿主。表达用杆状病毒通常是Autographacalifornicamultiplenucleopolyhedrovirus(AcMNPV)LifeCycleExpressionStartPromotersHoursPostInfectionInfectionDNAReplicationVirionProductionCellLysisImmediateEarly(0-6hpi)ie0ie1ie2DelayedEarly(3-6hpi)39kLate(3-24hpi)p6.9(basic)vp39VeryLate(18-24to72hpi)polyhedrinp10杆状病毒发展重要节点：19831ProductionofHumanBetaInterferoninInsectCells1993BAC-to-BACExpressionSystem1953Firstcomprehensivereviewofbaculoviruschemistryandbiochemistry1962Establishedcellstrainsfromtissueculturedinvitro1971Discoveryandidentificationofthebaculovirus,Autographacalifornicanuclearpolyhedrosisvirus1972ThestructureofNuclearPolyhedrosisVirusesI.Theinclusionbody1973AcMNPVwasisolated1978~1992Analysisofbaculovirusgenomesandusedtodeveloptherecombinantbaculovirusvectors2008~2019flashBac2011~2016GeneticengineeringofbaculovirusThestorycontinues…2007~2017Insectcellengineering义翘神州昆虫细胞发展重要节点：1983Establishmentofsf9（）(Spodopterafrugiperda)1994EstablishmentofTn-5B1-4

(HighFive)(Trichopulsiani)1915spermatidfromSamiaceropia1915~1958

Exploreinsectcellcultureinvitro1959Establishmentofovariancellline(Bombyxmori)1962Establishmentofovariancellline(Antheraeaeucalypti)1970Establishmentofsf21(Spodopterafrugiperda)1986EstablishmentofTn-5B1(Trichopulsiani)2010EstablishmentofAo38Thestorycontinues…义翘神州BEVS-IC优化义翘神州BEVS-IC的应用02义翘神州昆虫-杆状病毒与其他表达系统的比较：经济周期短高产量大肠杆菌表达系统后修饰匮乏易成包涵体难表达大分子蛋白酵母表达系统经济快速BEVS-IC后修饰高产量高细胞密度可溶表达周期长大分子蛋白成本高哺乳动物细胞表达系统修饰完全可溶表达周期长成本高义翘神州特殊糖基化类型

转化难度高应用场景重组蛋白的应用生物药结构生物学研究天然vs重组蛋白天然蛋白重组蛋白丰度丰度低无丰度限制动物源有无产率低高批间差不可控可控andsomuchmore…工业酶生物材料药物开发VLP/亚单位疫苗开发诊断试剂义翘神州表达流程义翘神州••SIMSF无血清培养基——专为Sf9和Sf21细胞设计货号：MSF1特点：无血清、无蛋白最大细胞生长密度：1.2×107cells/mLSf21细胞设计货号：MSF1特点：无血清、无蛋白最大细胞生长密度：1.2×107cells/mL：蛋白表达、Sf9/Sf21细胞培养、重组杆状病毒的包装和扩增昆虫细胞培养基义翘神州•SIMSF无血清培养基——专为Sf9和Sf21细胞设计货号：MSF1

特点：无血清、无蛋白

最大细胞生长密度：1.2×107

cells/mL

用途：蛋白表达、Sf9/Sf21细胞培养、重组杆状病毒的包装和扩增•SIMHF无血清培养基——专为Hi-5细胞开发货号：MHF1特点：无血清、无蛋白最大细胞生长密度：7.5×106cells/mL用途：Hi-5细胞的培养、重组蛋白表达•无动物源、无血清SIMSF培养基货号：MSF-AF特点：无血清、无蛋白、无动物源用途：蛋白表达、Sf9/Sf21细胞培养、重组杆状病毒的包装和扩增•无动物源、无血清SIMHF培养基货号：MHF-AF特点：无血清、无蛋白、无动物源用途：Hi-5细胞的培养、重组蛋白表达相同培养条件下，Sf9细胞在义翘神州和竞争品牌昆虫细胞培养基中的生长水平相同培养条件下，Hi-5细胞在义翘神州和竞争品牌昆虫细胞培养基中的生长水平SIMHFCompetitorACompetitorB酶转录因子超大蛋白跨膜蛋白病毒结构蛋白适用BEVS的蛋白类型分泌蛋白复合体义翘神州案例展示03义翘神州重组表达策略制定ProteinIDAccession#(UniPortorNCBI)AA/cDNAsequenceBasicparametersStructuralFeaturesReferenceDisordernessCyscontentS-SprofileHydrophobicitydistributionInstabilityprofileAssessmentMw,pI…TM,PTM,domainsConstructconstruct,affinitytag,QCmethodsandstandardsPilotPOCScale-upFeasibilityassessmentTrouble-shootingFormulation,activity,stability…蛋白最终应用决定表达和纯化策略义翘神州构建设计方案截去影响蛋白表达的区段Construct1Construct2

单次跨膜蛋白胞外区(MW=~90KDa)

昆虫细胞表达

纯化分泌蛋白

删去N端高疏水区促进蛋白分泌表达义翘神州构建设计方案功能区域串联表达Full-length(2511AA)，~70%purity,Yield<0.5mg/LEnoylreductase+Ketoacylreductase(~1000AA)Methyltransferase+Ketoreductase(~700AA)>90%purity,Yield>20mg/L

重组人脂肪酸合成酶（FASN）

多功能域复合酶昆虫细胞表达纯化胞内蛋白

通过功能区串联获得高产重组蛋白义翘神州AlphaFoldmotif的灵活运用Construct1：串联形式1Construct2：串联形式2功能性motif的构建形式对蛋白的聚集情况有明显影响义翘神州Buffer:PBSDetergentformula1Buffer:PBSDetergentformula2Buffer:PBSDetergent:DDMNi-affinitypurificationNi-affinitypurificationSECpurification不同Buffer蛋白对纯化的影响义翘神州整体策略优化

重组表达转录因子蛋白

蛋白高度无序，稳定性差

昆虫细胞表达纯化胞内蛋白

构建、培养和纯化过程综合优化Construct1:Nt-GST-TF,pilotN端融合标签观察到目标蛋白表达

目标蛋白未GSH梯度洗脱

目标蛋白降解严重Construct2:Nt-TF-GST,pilot(V1)Construct2:Nt-TF-GST,scale-up

培养体积=10XV1

蛋白降解

培养体积=V1

收集Elute2并置换Buffer

目标蛋白在高盐buffer中较为稳定Buffer[NaCl]=150mMBuffer[NaCl]=500mM高无序度蛋白Longestdisorderregion=166AA(166AA/384AA)Percentageofcoilstructure=79%C端融合标签观察到目标蛋白表达

目标蛋白未GSH梯度洗脱

目标蛋白降解缓解义翘神州美国子公司宾夕法尼亚州费城区北京总部上海分公司欧洲子公司德国法兰克福苏州子公司泰州子公司广州分公司日本子公司义翘神州义翘神州坚持自主研发生产打造中国生命科学研究“一站式”试剂与服务支撑平台人才与设施荣誉资质设施：---25,000+平米研发中心

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团队：900+---硕士以上学历占1/3---10+欧美深造经历14,000+

精品抗体6,500+

重组蛋白47,000+