遗传多样性及其研究意义

第十七章动物遗传资源保护与利用生物多样性指生命有机体及其赖以存在的生态复合体的多样性和变异性，确切地说，生物多样性是所有生物种类、种内遗传变异和它们的生存环境的总称，包括所有不同种类的动物、植物和微生物，以及它们所拥有的基因与生存环境所组成的生态系统。由此可见，生物多样性包括了遗传多样性、物种多样性、生态多样性和景观多样性四个层次。人类总是直接或间接地从生物界获取利益，生物多样性是人类赖以生存的条件，经济可持续发展的基础，人类是不能脱离其自身生存的多种多样的生物环境而孤立发展的。随着人口的增长，人类经济活动的不断加剧，以及不合理的利用生物资源，尤其是动物遗传资源，作为人类生存最为基础的生物多样性受到了严重威胁，无法再现的基因、物种、生态系统正以人类历史上前所未有的速度消失。全世界已有25000种植物和1000种脊椎动物濒于灭绝，今后20多年间，地球上生物多样性总量的1/4将面临灭绝的威胁。目前，人类社会已经认识到生物多样性危机的严重性，成为国际社会十分关注的热点话题之一，截此止1993年6月，包括我国在内的168个国家和地区在《生物多样性公约》签了字，全面揭开了生物多样性研究与保护工作，这表明，世界上绝大部分国家已经认识到保护生物多样性，尤其是动物遗传资源的保护是全人类的大事。动物遗传多样性遗传多样性是生态系统多样性和物种多样性的基础和核心，生物群落是构成生态多样性的基本单位。每个物种都有其独特的基因库，物种的多样性就由遗传基因的多样性显示出来。遗传多样性是指地球上所有生物携带的遗传信息的总和，主要指种内不同群体之间或一个群体内不同个体间遗传变异的总和，具体表现在种间或种内外部形态特征、染色体特征、生化特征、基因表达产物以及DNA分子水平的多态性。遗传多样性最直接的表达方式就是遗传变异的高低，通常包括遗传变异的分布格局，即群体的遗传结构。群体（居群）遗传结构上的差异是遗传多样性的重要体现，一个物种的进化潜力和抵御不良环境的能力取决于种内遗传变异的大小和群体遗传变异的分布式样。动物遗传资源是生物多样性的重要组成部分，它是一个国家、一个民族重要的战略资源，关系到国家主权和安全，是人类赖以生存的各种有生命资源的总汇和未来工农业、医药业发展的基础，为人类提供了食物、材料、医药等基本需求。它的重要的社会经济、伦理和文化价值无时不在艺术、文学以及社会各界对生物多样保护的理解与支持等方面反映出来，对于维持生态平衡，稳定环境具有关键作用，为整个人类带来了难以估价的经济、历史和美学价值。一、国内外动物遗传多样性概况（一）国外动物遗传多样性概况地球上出现生命以来，生物处于不断的进化和演变过程中，产生大约8500～4200万种物种，全世界已被科学描述的物种大约有162万种。全球被科学描述的动物种类概况有：哺乳动物4842种、鸟类9932种、爬行动物8134种、两栖类5578种、鱼类28100种、昆虫类950000种、软体动物70000种、甲壳类40000种、其他无脊椎动物130200种。生物多样性的丰富程度通常以其地区的物种数量来表达，并不均匀分布于每个国家，世界生物多样性主要分布于热带森林，占全球陆地面积7%的热带森林包括了全世界半数以上的物种，NAS确定了11个生物多样性丰富的热带地区，它们是：厄瓜多尔海岸森林、巴西“可可”地区、喀麦隆、坦桑尼亚山脉、亚马逊河流域东部和南部地区、缅甸、马达加斯加、斯里兰卡、苏拉威西岛、新喀里多尼亚、夏威夷；生物多样性丰富的国家有12个，它们是：巴西、哥伦比亚、厄瓜多尔、秘鲁、墨西哥、扎伊尔、马达加斯加、澳大利亚、中国、印度、印尼、马来西亚，这12个国家拥有全球60%～70%的生物多样性。丰富的生物多样性主要是由于它们广阔的疆域，多成分的地形、气候及长期的隔离所造成。（二）国内动物遗传多样性概况我国是世界上12个生物多样性最丰富的国家之一，在动物遗传多样性方面，中国脊椎动物共有6347种，占世界脊椎动物的13.97%；鸟类1244种，占世界鸟类种类的13.1%；鱼类3862种，占世界鱼类种类的20.9%。1.野生动物遗传多样性概况野生动物伴随着人类演化与发展历史进程，为人类提供巨大的物质和经济价值，如野生渔种向全世界提供了超过1亿吨的食物；野生动物为我们提供食品、药材和研究材料；在稳定生态系统的正常功能方面发挥有必不可少的作用。此外，野生动物在文化、社会、美感等方面也有重要价值，例如：大熊猫给予人类美感享受。我国已记载的野生动物种类丰富，超过2.5万种。毛类野生经济环节动物23种；海产野生经济软体动物152种，淡水经济软体动物104种，陆生经济软体动物184种；经济甲壳动物约1000种；昆虫2万多种；经济棘皮动物37种；鱼类约1000种；野生经济鸟类241种；野生哺乳动物162种。我国野生动物种类众多，孑遗种和特有种多，其中哺乳类73种，鸟类99种，爬行类133种，两栖类195种，鱼类440种，由于我国地域辽阔,地理环境多样，野生动物区系复杂，分布呈不均匀。2.家养动物（畜禽）遗传多样性概况家养动物是人们日常生活必需的生产和生活资料，由于我国地理环境的多样性，加之劳动人民长期的驯化和培育，形成了丰富的家养动物品种资源，特别是地方畜禽品种的优良物种特性，是祖先留下的丰富历史遗产，为新品种选育及畜牧业可持续发展发挥了重要作用。我国政府对畜禽品种资源保护工作历来十分重视，从20世纪50年代开始进行畜禽品种资源调查，先后出版了猪、牛、羊、家禽、马品种志。我国畜禽遗传资源主要有猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅、马、兔、鹿、蜂等21个物种，共计576个品种，其他地方品种为426个，培育品种73个，引进品种77个。全国家养动物普查结果表明，我国家养动物主要畜禽品种或种类有：黄牛73种、水牛26种、牦牛11种、大额牛1种、马66种、驴22种、骆驼4种、绵羊79种、山羊50种、猪113种、鸡109种、鸭35种、鹅26种、火鸡21种、兔14种、梅花鹿3种、马鹿2种、水貂1种、蜂11种。我国家养动物普遍具有适应性强，产品品质好，耐粗饲，繁殖力强等特点，但大部分畜禽品种与国外品种相比生长速度、产奶量、产蛋量等生产力水平偏低。3.渔业类遗传多样性简况我国有淡水鱼类804种，淡水虾类、贝类、螺类分别有62种、104种、56种。海洋鱼类有2156种；海洋磷虾类、蟹类、虾类分别有42种、600多种、300多种；海洋螺类、贝类分别为1583种、873种。（三）动物遗传多样性受威胁概况随着动物栖息环境恶化，人类利用活动加剧，动物遗传多样性受到威胁程度逐渐加剧，自1600年以来，世界上已有21%的兽类、13%的鸟类已经灭绝。现今地球上每年将有2～3万种生物物种灭绝，IUCN最近的统计表明，5%～20%的脊椎动物面临灭绝的威胁，目前，鸟类和哺乳类动物的灭绝率是地质时期的100～1000倍。据估计，全世界4500个畜禽品种的30%左右处于高度危险的境地，据第2版《红色警告—世界濒危畜禽品种名单》报告，世界哺乳类和禽类3882个品种信息，其中的559个品种被分级为高灭绝危险品种，鸡、牛、绵羊和马有许多资源处于灭绝的危险，马和家鹅濒临灭绝的品种比例最高，如登记在案的马有384个品种，处于灭绝危险的品种为216个，比例高达56.25%。中国既是动物多样性最丰富的国家之一，也是动物多样性受到严重威胁的国家，受到威胁的物种占区系成分的15%～20%。中国受危兽类和鸟类的种类排在世界前三位，受到威胁或濒危的兽类有128种，鸟类183种，爬行类96种，两栖类29种，鱼类92种。在家养动物方面，据1999年调查结果表明，我国已灭绝的畜禽品种达19个，仅近20年就灭绝了9个畜禽品种，其中牛品种3个，如荡脚牛、高台牛；猪4个，如豪杆嘴型内江猪、大普吉猪；羊1个，为枣北大尾羊；鸡7个，如九斤黄鸡、太平鸡；鸭1个；鹅3个，如文山鹅、思茅鹅。濒临灭绝的品种37个，其中牛品种4个，猪17个，绵羊1个，山羊2个，马3个，鸡10个；数量急剧减少的品种有牛7个，猪24个，绵羊2个，山羊2个，鸡5个，鹅1个，马7个，驴1个。二、动物遗传多样性保护的意义包括驯化了的动物（畜禽）在内的动物遗传资源为人类的生存提供了主要的动物蛋白，在人类的生活和发展中，如狩猎、运输、娱乐等诸多方面起着重要作用，它是同人类关系最为密切、最为直接的动物遗传资源。在特定的自然条件、社会经济条件和人工干预下，动物在驯化过程中形成了不同的种、品种和类型，是动物遗传多样性的具体表现形式。随着时空的演变，社会经济和科学技术的飞速发展，特别是改革开放以来，我国畜牧生产持续20年的快速增长，畜牧业生产的集约化、规模化程度越来越高，为了适应这种生产模式，培育和引进了大量品种，少数培育和引进品种在生产中占了主导地位，使我国畜禽遗传资源发生了一定的变化。外来品种的侵蚀和生境条件的恶化，我国畜禽遗传多样性的保护正受到巨大的压力。目前34%的牛，71%的猪，44%的马驴，20%的家禽，15%的绵羊等遗传资源受到不同程度的威胁。无论是从保护我国古老文明遗产和保护畜禽遗传资源特有基因，还是保存满足未来需求基因的角度，我国特有动物（畜禽）遗传多样性的保护都是一项紧迫的工作，具有十分重要的经济、科学和历史文化意义。1.保护动物遗传资源多样性，实现可持续发展战略动物遗传资源多样性具有不可再生性，一旦丧失，就很难恢复。例如，在过去100年中，全球450多个牛品种已灭绝。目前，180多个国家和地区在《生物多样性公约》签字，说明了动物遗传资源多样性是维持人类生存的物质基础，是实现可持续发展战略资源；随着社会经济的发展，难以预测未来变化的性质和程度，人类社会对动物产品的消费将提出新的要求。因此，仅凭少数畜禽品种维系的畜牧业不可能持续发展，只有保持畜禽品种遗传的多样性，才能满足人类社会经济和自然发展的需要。2.培育畜禽新品种，有利于提高畜牧生产水平，具有重要的经济意义畜禽良种是建设现代畜牧业，提高畜产品市场竞争力的基础。畜禽良种的培育依赖于畜禽遗传资源的优良基因。现代畜牧生产表明，畜禽遗传资源对食物和农业的贡献率达30%～40%。目前，生产上普遍使用的少数畜禽品种是人工培育和改良的品种，通常是使用闭锁繁育、级进杂交，高强度的人工选择而形成，都是为了满足目前人类生产的需要，使某些有利基因纯化程度较高，而控制其他性状的未知基因消失殆尽，特别是随着人工授精、胚胎移植等技术的广泛应用，只有数量很有限的公畜在繁殖后代，导致遗传背景贫乏，使畜禽遗传基础越来越窄，品种进一步改进的潜力减小。目前的一些高产品种自身存在着一些严重缺陷，如占全球奶牛饲养量90%以上的荷斯坦牛抗病力差，饲养中，60%的牛患不同程度的乳房炎。不同的品种对各种疫病的非特异性免疫性不同，例如，中国黄牛对焦虫病有抗性，而欧洲牛则没有。不同的品种具有不同的适应范围，而世界上的自然条件和社会条件千差万别，畜禽种质资源的危机，意味着畜禽种质所携带基因的危机或消失，其后果是造成畜禽种质遗传变异越来越少。遗传多样性越丰富，可供选择的遗传基础就愈丰富，育种潜力就越大，它的任何一点利用都可能在类型、质量、数量上给肉、奶、蛋和毛皮等动物在农业上带来创新，适应不断发展的人类社会对畜牧业的新需求。因此，满足人类需要的家养动物改良和新品种（系）的培育，依赖于家养动物遗传多样性，为畜禽育种提供基本素材。充分发掘地方品种的优良特性，培育适合未来市场需求的畜禽新品种，才能进一步提高畜牧生产水平，促进农业和农村经济的发展，具有重要的经济意义。3.科学研究意义生物在发展和繁衍后代的过程中，其遗传信息DNA能准确地复制并传递给后代，以保持遗传性状的相对稳定。然而在DNA复制、传递和表达过程中由于受生物自身内部的因素（酶的活性、体液酸碱度）、外界环境因素（物理或化学因素）的影响，可能引起单个碱基或碱基片段的变化，如碱基的缺失、插入、倒位、易位等，从而导致不同程度的遗传变异。遗传多样性的存在是自然选择和生物体自发突变动态平衡的结果，对于一个生物群体（种、亚种）在时间上是延续不断的，是进化的基本单位，随着遗传变异的不断积累，遗传多样性不断得到丰富，遗传多样性变异越丰富，群体对环境变化的适应能力越强，进化潜力越大。大量研究表明，生物群体遗传变异的大小与其进化速率成正比。因此，对遗传多样性进行研究，可以揭示生物群体（物种）的进化历史（如起源的时间和方式），也能为进一步分析其进化潜力和未来命运提供重要的资料，尤其有助于对物种稀有或濒危原因及过程的探讨。保护生物遗传多样性对于合理而有效的利用生物资源以及保护生物遗传资源具有十分重要的现实意义。通过研究种内遗传变异的大小，时空分布及其与环境条件的相互关系，才能采取科学有效的措施保护人类赖以生存的遗传资源，才能挽救濒于灭绝和受到威胁的物种。实际上人类早就注意到生物的多样性和持续性，生物分类学上地理族、种、亚种的划分，农作物和动物品种、品系的划分就说明了以上观点。现代生物技术已成为发展经济的重要手段，利用转基因动物生产低成本的药用蛋白，提高畜禽生长速度和繁殖力，控制人类和动物疾病等基因的鉴别和控制技术的研究，这些都依赖于特定的动物遗传资源。例如，加利福尼亚大学培育成功的近交系鸡被全世界广泛用于免疫学研究。4.历史、文化和美学意义动物遗传资源是伴随着人类文明发展史——动物驯化史和自然选择双重作用的结果，是人类的科学文化遗产，祖先留下的宝贵财富。我国地域辽阔、气候类型多样、地貌类型丰富，西南部有青藏高原的隆起，为各种生物种类的产生和繁衍提供了多样性的生境，悠久的历史和古老的文明，祖先留给我们许多优良的独特地方品种，使我国成为世界上动物遗传多样性最丰富的国家，对这些遗传资源进行保护和鉴定为我国历史文化遗产提供了活的见证。人类还从动物遗传资源中得到快乐和美感，例如，饲养宠物，参观动物园，自然保护区生态旅游等。三、动物遗传资源保存的主要问题（一）野生动物栖息环境恶化，生存受危程度加剧全球气候变暖，过度放牧，草场沙漠化加剧；人口膨胀，城市用地及工矿用地扩张，毁林开荒等使森林面积降低，造成野生动物栖息生态环境恶化，栖息地缩小。水资源受到工业排污、农药、酸雨、原油的污染，使一些重要经济鱼类的产卵场、索饵场受到污染，导致鱼类和两栖类爬行动物资源减少。围湖造田、筑坝修电站，使渔业类栖息地减少，洄游路线阻断，导致天然水域中主要经济鱼类数量降低，珍稀水生动物资源严重衰竭。例如：我国的“四大家鱼”，由于自然资源减少，绝大部分依赖于人工繁殖，由于人工繁殖的局限性，导致物种退化，表现为抗逆性下降，个体缩小，生长速度降低，使其遗传多样性呈下降趋势。（二）外来物种入侵，造成大量本土优良品种数量减少或丧失随着商品经济的发展，追求当前片面的高效益，大量引进外来畜禽新品种，渔业新品种，对有重要遗传资源的本地品种进行杂交，同时，造成生存竞争，致使本地品种遭到淘汰，造成数量减少甚至灭绝，动物的遗传多样性降低。在猪、牛、羊、家禽方面，生产中大力推广二元和三元杂交，饲养洋三元猪，导致地方畜禽良种数量的减少和灭绝。如：我国21个地方畜禽良种数量减少，93%的猪，35%的牛的种质资源受到不同程度的威胁；上海的荡脚牛、江苏的九斤黄鸡、枣北大尾羊、项城猪已完全灭绝；云南的湖泊散养外地鱼种后导致本地九种稀有鱼种消失；虾夷扇贝的引进已威胁到本地的栉孔扇贝。（三）动物遗传资源收集与保护力度不够，研发水平低我国政府历来重视动物遗传资源的保护工作，在全国各地建设了规模较大的动物遗传资源基因库，如：建设了78个畜禽保种场，1551个自然保护区。然而，我国地域广阔，生态区系复杂，历史悠久，具有丰富的种质资源，还有大量的畜禽、渔业、野生动物遗传资源处于未知状况，种群遗传结构不清楚。遗传资源保护与研究系统不健全，相互之间缺少联系。我国动物遗传资源保护绝大部分工作停留在收集、表型鉴定上，例如：我国2005年开始的全国畜禽种质资源大规模普查工作也没有涉及分子水平研究。国际上发达的国家（如：美国、英国）已经普遍深入到分子水平，采用分子标记技术对动物遗传资源进行鉴定，并开发出一些对人类有重大作用的基因。我国动物遗传资源基因型鉴定还处于起步阶段，遗传资源创新研究工作薄弱，专门保护种质资源的家畜野生亲缘种不多，家养畜禽品种资源的收集、整理、鉴定有许多工作要作，原位保存难度大，异位保存存在技术难度，例如：鱼类胚胎超低温保存技术有待进一步研究。（四）缺少系统的管理法规和权威的管理机制尽管我国政府和有关行政部门颁布了一些动物遗传资源管理的法规制度，如：《种畜禽管理条例》、《水产资源繁殖保护条例》、《畜牧法》等。然而，这些法规对畜禽遗传资源的出境管制、利益分享没有涉及到，也没有健全配套的管理制度和保护措施。工作体系不健全，对动物遗传资源的管理不规范，多部门管理，各施其政，难以协调整合和统一行动，尚未设立国家物种资源管理机构，未能统筹规划国家动物遗传资源调查与收集、引种与交换、整理和保存、评价与利用等工作平台。由于缺乏健全的管理法规，资源调查与收集无权威机构审批，出现乱采乱收现象，许多资源外流严重，呈现了有损国家种质资源主权和安全的混乱局面。有法不依、执法不力、管理不能到位，由于执法不力，非法偷猎越演越烈，例如：1985—1987年，大熊猫被猎杀62只，不少国家珍稀动物如：马鹿、藏羚羊被猎杀，每年高达几万只，非法引进，输出的遗传资源远远超过官方正规渠道交换的进出口数量。（五）经费投入不足，科技队伍不稳定我国动物遗传资源工作尚无固定经费投入，依赖科研项目经费维持其运行。美国参与遗传资源研究和管理人员平均经费10万美元，第三世界国家的印度，保存资源20万份，每份年耗资5.5美元，我国年饲养400头以上的猪、牛保种场，国家年投入100～300万元，其维持举步艰难，不能开展正常的科研工作，导致科技队伍不稳定，大量从事资源工作的科技人员流失，严重影响了种质资源发展战略和系统工作的展开。（六）国际合作较少我国畜禽种质资源的收集绝大部分限于国内，与国际合作机会较少，多数发达国家已开展国外种质资源的引进，如：美国有80%的遗传资源来自国外，俄罗斯也有50%来自国外。动物遗传多样性的评价方法在进行动物遗传资源保护之前为了制定保存开发利用的政策，战略和行动计划，需要明确了解遗传资源的基本状况，对其遗传多样性进行评估，以发布相关信息和引起社会各界的关注。动物遗传多样性可以从形态特征、细胞学特征、生理特征、基因位点及DNA序列等不同方面来体现，若要实现遗传资源合理的系统保护与开发利用的措施，须确定与各物种相适应的评价内容，并采取与之相适应的评价方法，对该物种的遗传多样性进行准确、科学的评价，为物种保存与利用的决策、措施提供科学的依据。一、动物遗传资源评价的内容动物遗传资源评价除动物物种自身的遗传信息作为评价的主要内容外，还应包括与遗传资源相关的信息，如分布地域的地理信息，保护计划等，动物遗传资源评价的主要内容有如下几方面：1.种群资源信息包括种群规模大小、主要分布地域、主要体型外貌特征、生产性能、特有种质特性、抗病力、遗传结构、起源与进化关系、受危程度。2.主要栖息地的自然生态条件包括气候特点、土壤性质及农作物种类。3.影响遗传资源变动的因素人为因素、自然条件的变化状况、外来物种的入侵状况。4.保护措施特定区域的划定、保护设施的建设情况、维持的方法和保护计划。5.资金的投入和队伍建设资金的来源渠道，包括政府拨款、募捐、项目资金，资金的使用计划、日常维持人员、科技人员。6.遗传资源的采集和分析对动物遗传资源进行普查，确定遗传资源采集的数量、采集方法、并对所收集的物种资源进行常规和分子水平的分析。 此外，评价的内容还包括遗传资源保护的主要问题、建议书和建议活动。二、动物遗传资源评价的方法动物遗传资源评价的方法多种多样，不同的技术方法从不同角度，不同层次揭示居群的遗传信息。20世纪50年代中期以前，主要采用观察测量的方法对居群的毛色、体态等外部形态特征、地理分布的多样性进行分析。20世纪60年代以来，随着细胞遗传学实验技术的发展，蛋白质电泳技术的出现，对物种染色体的数目、形态及带型，基因表达产物（酶、蛋白质），血型，抗原和抗体的多态性进行了研究。外部特征数量有限，且受环境影响大，不能真实反映物种的多态性；易于分析的蛋白质的主要变异体种类很小，从而限制了蛋白质电泳技术作为物种多样性研究的利用。动物居群遗传变异其实质是遗传物质DNA的差异，直接研究DNA的变异更具有重要意义。近20年来，随着分子技术的迅速发展，以分子杂交和PCR为基础的分子实验技术，在DNA分子水平研究居群的遗传结构差异，起源分化，地理分布差异等方面得到了广泛应用，为揭示动物多样性的本质发挥着重要作用。DNA分析具有以下几方面的优点：（1）直接以DNA形式出现，无上位效应，不受环境的影响；（2）多态性丰富，几乎遍及生物体整个基因组；（3）根据研究目的的不同，可从基因组中提取所需的遗传标记；（4）分析材料获得的面广，不仅可以从现存的生物体，还可从残留的痕迹（微量材料）、陈旧材料（标本、保存年代上100年、化石）中提取DNA并进行分析；（5）从分析方法讲，各种类型的DNA基本上通用。（一）动物遗传多样性检测的方法 1.形态学方法就是对动物形态特征和表型性状的描述来检测遗传变异，形态特征和表型性状是遗传变异最直接的表观，形态特征主要包括体型特征、毛色、角型、冠型、头型、肤色、成年畜禽的各种体尺等方面进行描述。动物性状包括质量性状和数量性状2两大类，对数量性状的研究采用数量遗传学的方法，将遗传因素和环境因素区分开来，同时分析遗传和环境的交互作用。缺点是表型变化并不能如实反映遗传变异。2.细胞遗传学方法细胞遗传学方法是在染色体水平检测遗传变异，即进行核型分析，染色体变异主要体现为染色体组型特征的变异，包括染色体数目、形态和结构变异。染色体多样性检测主要对细胞分裂时期染色体的数目和形态特征（如相对长度、臂比值、着丝点位置、臂指数等）加以分析，即核型分析。不同种类的生物或同种生物的核型不同。但某些种类，特别是种以下水平居群间，其组型和染色体特征差异不明显，则必须对染色体进行分带处理，显示深浅不同的染色体带纹，如C带、Q带、G带、R带、T带等。显然，细胞学标记的数目也很有限。3.蛋白质检测方法采用电泳技术按照蛋白质的静电荷和相对分子质量把不同形式的蛋白质分开，测定某一蛋白质位点的遗传变异水平。某一物种DNA全基因组中有一个碱基发生变化，导致mRNA碱基组分的变化，其中一些变化会引起翻译的蛋白质的改变，通过电泳，不同蛋白质在凝胶中的迁移位置不同，特定位点的蛋白通过专一的酶活性用组织化学染色而检测出来。蛋白电泳通常采用含有各种大量可溶性蛋白质的组织和器官，如动物的血液，肝脏等作为试验材料。蛋白质检测中常见的有血液蛋白多态性分析和同工酶分析2种方法。4.分子生物学方法随着分子生物技术的发展，许多学者将分子生物技术的方法应用于遗传资源的评价，从分子水平研究畜禽品种的遗传多样性、遗传结构及其系统发育关系，为畜禽遗传资源的保护和利用提供了最直接的理论依据。目前，采用的主要方法有：限制性酶切片段长度多态性分析，扩增片段长度多态性（AFLP）分析，随机扩增多态DNA（RAPD）分析，单位点微卫星多态性分析，序列标记微卫星分析，DNA单链构象多态性（SSCP）分析，DNA序列测定及基因芯片分析技术。（二）动物遗传多样性评价指标1.平均数和变异系数对表型性状进行测量后，利用生物统计学方法计算性状的平均数和变异系数，并进行差异显著性检验。2.基因和基因型频率基因频率指某一位点上不同的等位基因所占的比例；基因型频率指一个群体中某一性状的各基因型间的比率。3.遗传平衡检验利用基因型频率，采用X2检验，检验群体遗传结构是否符合哈代-温伯格平衡定律，用于衡量群体遗传的波动情况。4.遗传变异的度量参数大多数生物的自然群体具有大量的遗传变异，在一个群体中，存在两个和多个有着相当高频率（通常大于1%）的等位基因时就称为遗传多态性。一个座位的遗传多态性是由各种突变产生的，如核苷酸替代、插入、缺失、基因转换和等位基因间的重组等，遗传多样性依赖于群体多态性程度的测度。要评价一个群体的遗传变异就必须研究多个座位，理想的方案是研究所有的遗传座位，但实际上这是不可能的。因此，一个群体的遗传变异通常是通过从基因组中随机抽取不同的座位来研究。一个群体中遗传变异度量适宜的尺度是平均期望杂合度，核苷酸多样性，核苷酸替代平均数目。（1）平均期望杂合度：平均期望杂合度又称基因多样度，一个座位的基因多样度定义为：h=1-，Xi是第i个等位基因的群体频率，q是等位基因的数目。实际上，我们并不知道群体的等位基因频率，所以需要从群体中抽取m个个体进行估计。对于二倍体生物，一个共显性座位上的等位基因Ai的频率为：=,是基因型的样本频率，这个座位上的基因多样性为:=2m(1-)/(2m-1)，当研究L个座位时，平均基因多样性估算为：/L（公式17-1）（2）核苷酸多态性：一个不依赖于样本大小m的DNA多态性的测度是两个序列间每个位点上核苷酸差异的平均值或是核苷酸多样性。定义为：π=（公式17-2）q是不同等位基因序列的总数，Xi是第i个等位基因的群体频率，dij是第i个和第j个等位基因间每个座位的核苷酸差异数。在一个随机交配群体中，π是核苷酸水平上的杂合度，可由下式估算：=（公式17-3）（3）核苷酸替代平均数目：群体间DNA差异由核苷酸替代平均数目度量。假定在一个特定的DNA区域上有q种不同的等位基因并且分别从群体X和Y中抽取Mx和My条序列，设Xi和Yi分别为群体X和Y的第i种等位基因的样本频率。在群体X（dx：核苷酸多样性）中的一对随机等位基因的核苷酸替代平均数目可由下式估计：（公式17-4）5.遗传距离估计数学模型群体中多态座位或多态序列类型即单倍型是遗传进化的基本形式，是核苷酸随时间变化而发生的序列改变。这种变化既可用来估计进化的速率，又可用于重建生物的进化史。我们所观察到的序列类型间的变异是几十万乃至数百万年进化的结果，因此，必须借助给定序列与进化上共有祖先序列的比较，并建立核苷酸替换概率的数学模型，依此计算各单倍型或群体间的遗传距离，重建研究对象的进化史。目前，常用的数学模型有：（1）P距离模型：该距离描述序列分歧大小的测度是两条后裔序列中不同核苷酸位点的比例。（公式17-5）为估计核苷酸间的P距离，nd和n分别为所检测的两序列间不同核苷酸数和配对总数。该方法计算简单，较粗糙，但比较序列间的距离小时（p﹤0.1）,用它构建的系统树与复杂方法构建的结果实质上一致.（2）Jukes-Cantor距离模型：该模型假设任一位点的核苷酸替代都是以相同频率发生的，每种核苷酸的替代速率相等，均为3α（α为核苷酸替代速率），遗传距离为：d=-(3/4)ln[1-(4/3)p]p=1-q为X与Y间不同核苷酸的比例；q为X与Y间相同核苷酸的比例。（3）Kimura两参数距离模型：在实际数据中，转换替代速率常高于颠换速度，基于此情况，Kimmura（1980），提出一种估计每个位点核苷酸替代数的方法。该模型中，每年每个位点转换替代率（α）不同于颠换替代率（2β）。对转换对（Q）和颠换对（P）的每一个总频率进行估计：P=（1/4）（1-2e-4(α+β)t+e-8βt）（公式17-6）Q=(1/2)(1-e-8βt)（公式17-7）d=P+Q（公式17-8）动物线粒体DNA中转换替代数通常大于颠换替代数（Brown等；1982），木村（1980）为此将转换和颠换速率分开，建立了基于转换速率α和颠换速度β的双参数最大似然估计。（4）Tajima-Nei距离模型：该模型假设核苷酸频率的静态分布来估计替代数d，其基础是等输入模型。d=-bln(1-p/b)（公式17-9）b=(1/2)[1-+p2/c]（公式17-10）C=/2gigj（公式17-11）实际上，由于核苷酸替代速率不等，b通常小于3/4，该方法可得到优于Jukes-Cantor模型的核苷酸替代数估计。（5）Tamura距离模型：真实数据中,不同核苷酸频率不等，且GC含量常常偏离0.5，为此，Tamura（1992）提出了一种估计d值的方法，此模型是将Kimura两参数模型扩展到不同GC含量的情况。d=hln(1-p/h-Q)-(1/2)(1-h)ln(1-2Q)（公式17-12）h=2θ(1-θ)，θ为GC含量。（公式17-13）（6）Tamura-Nei距离模型构建系统树中常用的数学模型之一是Hasegawa等（1985）提出的最大似然模型（HKY模型），该模型中的公式十分复杂。Tamura和Nei（1993）在此基础上提出了一般化更便于适用的计算方法，它包括作为特例的HKY模型并可获得d的解析解。6.系统发育分化推断方法不同的基因或DNA片段的进化速率存在较大的差异，我们可以通过这些基因或DNA片段来研究几乎所有水平上的有机体（属、种以及种内群体）的进化关系。系统发育分析就是阐明多基因家族的进化式样及分子水平上适应性进化的进程。某些统计方法用于分子数据的系统发育分析，构建系统发育树，对居群的系统发育和演化进行推断。（1）距离法：在距离法中首先获得所有分类群间的进化距离，系统发育树的构建基于距离值之间的关系，已被证明能有效用于实际数据分析的方法有：1）算术平均不加权的组对法（UPGMA）：该方法最早由Sokal和Michener（1958）提出，目前使用的是SreathandSokal（1973）改进的方法。进化距离测度通过对所有的物种对或序列对计算获得：dAB=（公式17-14）r、s分别表示聚合A和聚合B内的种数，dij是聚合A中的种i和聚合B中的种j间的距离，两个聚合之间的分支点为dAB/2。当基因替代速度恒定或具有较小变异系数的距离测度时，用基因频率数据来重建系统发育树时，能构建出较其他距离法更好的树。检验UPGMA树的可靠性可使用内部分支检验或自展法检验。2）最小二乘（LS）法：实际中谱系间的核苷酸替代速度不同，UPGMA法常给出错误的拓扑结构。为此，avalli-sforza和Edwards（1967）提出了用最小二乘（LS）法构建拓扑结构的方法。该方法采用最小二乘法估计分支长度（d），再估计残差平方和（Rs），Rs最小的拓扑结构即为最终的树：Rs=（公式17-15）各种拓扑结构确立以分支换算法来检验。3）最小进化（ME）法：该方法是所有分支长度估计的和为：S=（公式17-16）所有可能的拓扑结构都要计算出S值，具有最小S值的拓扑结构被挑选作为最优树。bi表示对第i支长度的估计，T是分支的总数。采用Z检验来检验拓扑结构。（2）邻接（NJ）法：ME法有较好的统计学特性，但物种数目较大时，需要相当长的计算时间，Saiou和Nei（1987）基于最小进化原理，提出了邻接（NJ）构树方法，并认为是简化的ME法。（3）最大简约法（MP）：Fitch（1971）和Hartigan（1973）发展了一种严谨的MP算法，用于核苷酸序列数据，考虑4个或4个以上的核苷酸序列（m4），假设4种核苷酸可突变为与自身不同的任何一种，这样对于任一给定的拓扑结构，可以推断每个位点的祖先状况，对这一拓扑结构计算出用来解释整个进化过程所需核苷酸的最小替代数目，对所有可能正确的拓扑结构进行这种计算并挑选出所需替代的最小拓扑结构作为最优系统树。构建MP系统树首先估计核苷酸的最小替代数目（树长），然后确定MP树。当所分析的序列数或类群数（m）﹤10时，寻找MP的方法可采用穷尽式搜索；m﹥10时，采用启发式搜索，可通过分支限界法，核心树和分类群加入的顺序等算法提高获得MP树的概率。最后建立一个可以代表所有等价简约树的复合树即一致树。检验自展一致树可靠的有效途径就是使用自展法检验。（4）最大似然法（ML）：Felsenstein（1981）提出的基于核苷酸序列数据的一种用最大似然法构建系统树的算法。ML法以一个特定的替代模型分析既定的一组序列数据，使所获得的每一个拓扑结构的似然率均为最大，挑出其最大似然率最大的拓扑结构选为最终树。所考虑的参数不是拓扑结构而是每个拓扑结构的枝长，并对似然率求最大值来估计枝长。ML法获得系统树的方法与ME法、MP法相似。遗传多样性保护理论和方法动物遗传多样性保护就是保存物种群体的遗传多样性，即种质的多样性，其实质是保护种群的各类遗传变异，也就是保存一个群体的基因库平衡，使其每个基因不被丢失，达到这一目的的技术理论采用群体遗传学的哈代-温伯格平衡定律，即在随机交配的大群体中，在没有选择、迁移、突变等因素的影响下，基因频率在各世代间保持恒定不变。任何引起基因频率变化的因素都会造成平衡的变化。动物遗传多样性保护有原位保存和异位保存两2种方式，原位保存就是在自然生态环境条件下维持一个活体动物群体；异位保存就是利用精液、胚胎、细胞和DNA文库保存物种群体的遗传资源。通常，保护的物种群体都是小群体，小型群体会发生近交，增加遗传多样性丧失的风险。对近交衰退，基因流的降低、遗传漂变、有害突变的积累等遗传学知识的应用有助于物种保护，以减缓物种灭绝。一、原位保存的群体遗传学基础遗传多样性保护的结果主要是防止近交造成的衰退，防止近交衰退的主要技术理论是近交系数在世代间变化要小，通常用近交增量（△F）来表示，决定群体近交系数增量大小的参数为群体有效含量（Ne），群体有效含量指与实际群体有相同基因频率方差或相同的杂合度衰减率的理想群体含量。当初始群的近交系数为零时，第t代的近交系数Ft与近交增量的关系为：Ft=1-(1-△F)t影响保种群体近交系数增加的主要因素有：有效群体含量，公母性别比例，留种方式，交配体系，世代重叠及世代间隔等。1.有效群体含量动物在实际保种群中，群体规模大小不等，导致有效群体大小不等，小型群体产生遗传漂变，导致近交系数增量发生变化，若群体中公母的数量分别为Nm和Nf，则有：Ne=1/4Nm+1/4Nf（公式17-17）△F=1/2Ne（公式17-18）ne=1/4Nm+1/4Nf2.群体公母比例在实际的保种群中，繁殖个体雄性和雌性数目经常不等，通常使用较少的雄性和较多的雌性较经济，有效群体含量比实际群体规模要少。雄性数量（Nm）和雌性数量（Nf）与近交系数增加近似关系：△F=1/8Nm+1/8Nf（公式17-19）3.留种方式保种群中通常希望尽可能低的近交系数，除增加群体数量外，通过亲本个体的选择，减少家系大小的方差，使其低于随机数量，从而增加有效群体含量来降低近交系数增量。采用家系等量留种，即每对亲本的后裔中选留公母各一个个体，群体的有效含量近似的为Ne=2N；若采用随机留种，各家系留种雌雄数目不等，则有：△F=3/32Nm+1/32Nf（公式17-20）4.世代重叠在保种群中，现存的个体都处于不同的年龄和不同的生活周期阶段，世代不是分离的而是重叠的，终身寿命的差异加上繁殖力的差异，增加了家系大小的方差，从而导致有效群体数目的变化。Ne=4NeL/(VK+2)（公式17-21）式中：Ne=Nt/E，Nt:统计时存活总数，E：平均寿命，L:世代间隔，即后裔出生时双亲的平均年龄，VK:家系大小方差。可见，延长世代间隔，可增加有效群体含量，从而降低近交系数增量。5.世代间群体数量不等群体在不同世代间数目是变化的，对于t世代而言，平均群体有效含量是每一世代中的数目的调和平均值，在t世代的整个期间为：1/Ne=[1/t]×[1/N1+1/N2+…+1/Nt]（公式17-22）则有：△F=[1/2t]×[1/N1+1/N2+…+1/Nt]（公式17-23）6.交配体系近交使纯合基因频率增加，杂合基因频率降低，导致基因丢失。在随机交配的基础上，避免全同胞、半同胞、亲子等亲缘关系较近的个体间交配。将群体划分为不同的亚群体（品系），不同亚群体的亲缘关系较远，在亚群体间采用轮回交配，避开有亲缘关系个体间的交配，可有效地控制近交系数增长过快。二原位保存的基本方法根据上述群体遗传学的基本原理，为了在整体上保存一个品种的遗传结构稳定，一般应采用以下的措施：1.制定保种计划保种只保护生产性能优良、具有特殊性能和潜在价值的品种，保种计划中包括保种的目的、保种地点、保种群大小、保种的年限及繁育方法等。2.品种调查摸清各品种的数量、分布及生产性能，尤其是特殊性能和潜在价值的性能，并对品种资源进行评估。3.选择保种基地保种基地一般选择在主产地区。该基地有明确的地理界限，基地内不能饲养相同畜种的其他品种，便于生殖和地理隔离，基地内饲料资料应丰富，有足够的面积支撑载畜量。4.建立适度规模的保种核心群选择符合品种条件的优秀纯种组成核心群，个体无亲缘关系。保种规模可根据各代近交系数增量的要求进行确定，一般要求每代F小于0.5%，猪、羊等中等大小家畜的群体有效含量应为200头，牛、马等大家畜的群体有效含量应为100头，并且要保证有足够的公畜，以维持一定的性别比例。5.实行各家系等量留种在每一世代留种时，实行每一公畜后代中选留一头公畜，每一母畜后代中选留相同数量的母畜，并且尽量保持每个世代的群体规模一致。6.制定合理的交配制度在保种群体中避免全同胞、半同胞交配的不完全随机交配制度，或采取非近交的公畜轮回配种制度，可以降低群体近交系数增量。也可以采用划分亚群，并结合亚群间轮回交配的方式。此外，适当延长世代间隔，也可以降低群体近交系数增量；外界环境条件要相对稳定，控制污染源，防止基因突变。三、新技术在遗传多样性保护中的应用传统的保种方法具有投入经费大、消耗的人力、物力资源多的缺陷，同时，保种过程难以避免的技术难点是近交系数的增加，使纯合基因型增加，杂合基因型减少，导致遗传多样性降低，随着冷冻生物技术、分子生物学技术的发展和应用，这些新技术在动物遗传多样性保护方面发挥越来越重要的作用。1.冷冻精液保存技术自20世纪50年代英国的smith和Polge研究牛冷冻精液保存方法取得成功后，经过50多年的发展，精液的冷冻保存技术对大多数动物的精液进行长期保存已基本可行，特别是奶牛、黄牛、水牛、绵羊、山羊的冷冻精液技术已经广泛使用。猪、马、家禽等动物的精液冷冻效果有待进一步提高。冷冻精液保存技术就是采集雄性动物的精液，加入稀释剂和保护液以颗粒或细管的方式，在-196℃的温度下进行保存。目前，世界上大多数国家已建立动物冻精库，动物冻精保存不受时间、区域和动物寿命的限制；冻精保种只能保存品种50%的遗传基因，若要获得与现有遗传特征基本一致的品种，必须通过人工授精对动物进行多世代的回交。2.冷冻胚胎保存技术哺乳动物的冷冻胚胎自20世纪70年代首获成功，目前，已在奶牛、黄牛、水牛、山羊、绵羊、兔、小鼠等20多种哺乳动物上获得成功，牛的冷冻胚胎在北美、欧洲一些地区已进入商业化阶段，大规模地应用于养牛生产。胚胎来源有活体超数排卵及体外受精（IVF）2种方法。我国农业部已建立畜禽种质资源保存利用中心，已冷冻保存牛、羊等家畜的冻胚2000多枚。冷冻胚胎保存动物遗传资源与其他保存技术相比具有突出的优越性，胚胎保存了品种的全部基因，若有数量充足的胚胎，可保存与现有物种遗传多样性一致的遗传资源。细胞可以在超低温条件下长期保存，即使活物消失，只要存在同种物种，通过胚胎移植和核移植技术就可恢复这些遗传资源，因此，在保护动物遗传资源，尤其是挽救濒危动物方面，冷冻胚胎技术发挥越来越重要的作用。当然，冷冻胚胎亦存在潜在的危险，就是经过长期的超低温保存，是否引起配子的遗传变异现在无法评估。3.建立DNA文库的基因保存技术遗传资源就是基因资源，基因是存在DNA分子上的遗传信息，保住了DNA就是保住了遗传资源。从DNA水平可以全面、准确地分析种群的遗传变异。自人类基因组计划实施以来，全球同步开展了猪、牛、羊、马、家禽等动物遗传图谱和物理图谱的构建工作，一些影响数量性状较大的QTL得到定位，利用基因克隆技术可以组建动物基因组文库，使一些独特的遗传资源得到长期的保存，将来需要时可通过转基因技术在动物群体中出现，DNA文库是活体保种的一种有效补充形式，我国已保存363个地方猪品种，85个地方牛品种，71个地方羊品种共13000多份个体的基因组DNA。4.构建细胞库保存遗传资源技术细胞包含生物所有的遗传信息，保存了细胞就保存遗传资源，现将构建细胞库的主要技术简介如下。（1）实验室准备工作：1）实验室要求和所需主要仪器设备细胞体外培养的实验室要求无菌操作，防止微生物污染和有害物质的影响。按功能不同把细胞培养实验室分为准备室、缓冲室、培养室等3个主要部分。准备室主要用于培养器皿的清洗、包装、培养物质的准备和消毒以及供应物品的保藏等。布置于该室的设备主要有水槽和盛物台、烤箱、电热干燥消毒箱、高压蒸汽消毒器、水纯化装置、物品准备台以及其他附属设备。缓冲室的主要作用在于减少工作人员将外界污染物带入培养室的可能，一般在3～5平方米即可。培养室常被称为无菌室，专门用于细胞培养和各种无菌操作。该室应尽量避免受到外界环境的污染，其基本要求为：清洁、无菌、干燥和不通风。一般放置的仪器设备有：超净工作台、倒置显微镜、二氧化碳培养箱、真空泵、冰箱、低速离心机等。培养室和缓冲室的天花板上均应吊装消毒用的紫外线灯，以保证杀毒效果，紫外灯距地面不超过2.5米。另外，在构建细胞库作为遗传资源长久保存时还需要相应的超低温冷冻保存装置及贮备室。常用的就是液氮灌和低温冰箱，可以根据具体情况选择不同的型号。2）细胞体外培养所需的主要器具用于细胞体外培养的器具主要有过滤除菌装置、手术器械、培养器皿、移液器。大部分培养用液只能通过过滤的方法进行除菌消毒。常用的过滤除菌装置有Zeiss滤器、玻璃漏斗式滤器和微孔滤膜滤器等。在操作过程中使用的主要手术器械包括手术刀柄及刀片、组织剪、虹膜剪、镊子、持针器等。体外培养需使用大量的各式器皿，可分为一次性和可重复使用两类，主要有溶液瓶、培养瓶、玻璃锥形瓶、培养皿、多孔培养板、移液管和吸管、移液器等；另外一般还配备了筛网和细胞刮刀等特殊用具，筛网用于过滤消化处理后的细胞悬液，细胞刮刀用于将贴壁生长的培养细胞从培养器皿的壁上刮下来。3）细胞体外培养所需的培养用液培养用液指为保证细胞体外生存和生长而提供的各种溶液，主要包括培养基（液）、缓冲液、平衡盐溶液、血清以及消化液、PH调整液和抗生素液等其他常用液。培养基按来源不同分为天然培养基和合成培养基。天然培养基主要包括各种动物血清、水解乳蛋白以及自制的体液或组织提取液等。动物细胞培养常用的血清有胎牛血清、新生牛血清或成年血清、马血清、鸡血清、兔血清、羊血清以及人血清等。其中以胎牛血清、新生牛血清应用最广泛。合成培养基指根据模拟、借鉴细胞在体内生存生长的各种条件设计出类似体内环境而适宜细胞在体外生存和生长的各种培养基。合成培养基已被广泛应用于体外培养实验。（2）细胞系的构建：细胞系是指从原代培养物经过传代培养后获得的一群不均一的细胞，可分为有限细胞系和无限细胞系。在体外生存期有限的细胞系称之为有限细胞系；在体外可以持续生存，具有无限繁殖能力的细胞系称为无限细胞系。1）培养方法的选择由于培养的对象不同，拟放置的培养器皿不同以及维持生存与生活所需条件的差异，细胞体外培养可分为许多不同的方法和技术。常采用细胞培养方法有：悬滴培养法、培养瓶培养法、盖玻片培养法、旋转管培养法、克隆培养法、中空纤维细胞培养技术、微载体细胞培养法和灌注小室培养法等。现简单介绍几种常用的方法。①悬滴培养法：悬滴培养法又可分为单盖片悬滴培养法和双盖片悬滴培养法。单盖片悬滴培养法是最早建立的体外培养经典方法，它是将组织或器官植块接种在基质盖片上（一张盖玻片），加上一滴培养液，翻转基质盖片，使植块及营养液滴悬挂在生长基质表面，置基质盖片于一凹载片上，用蜡密封后放入培养箱中培养。双盖片悬滴培养法是将植块种植在生长基质盖片上，而用另一张盖玻片封闭培养环境，其要点在于在更新培养基或者继续培养时只需将旧的载体玻璃片取下，换上另一张无菌的载体盖波片，无需更换种植组织块的生长基质盖片，因而极大地方便了更换培养液的过程，减少培养基被污染的概率。②培养瓶培养法：指将培养对象直接接种在培养瓶内再入培养箱进行培养的方法。一般采用的是一次性使用的塑料培养瓶。对用于细胞培养的培养瓶有特殊的要求，第一是用于制造培养瓶的玻璃或塑料材料对细胞无毒害作用的透明物质；第二，培养瓶要具有适于显微镜进行观察的扁平形状。可根据具体情况选用不同规格大小的型号。③旋转管培养法：对传统的培养瓶培养皿而言，进行培养的主要方式就是将培养物在培养液中静置培养，细胞周围的营养环境、气体环境以及代谢产物基本上都是由物质逐渐扩散得以保持的，具有细胞周围的物质环境不均匀的缺点。旋转管培养法就是为了解决这个问题而发展出来的，它是将所培养的组织细胞接种在一管状培养皿内，再将旋转管固定在一可旋转的装置上，边旋转边培养；其优点在于所培养的组织细胞将交替接触培养液和气体环境，有利用组织的均匀生长。④克隆培养法：也称为单细胞分离法，是将从细胞悬液中获得的单个细胞用于培养，使之分裂增值而产生一个细胞群的培养方法。它强调培养产物的单一性而排除异质性，所获得的培养产物为遗传特性几乎完全相同的纯细胞系，即细胞株。2）样品的采集与处理构建细胞库的样品主要有动物胚胎和成年动物组织。在遗传资源保存的细胞库构建中常常使用的是采集成年动物组织，取材部位一般在体表，如耳组织。取样步骤为：=1\*GB3①对取材部位进行消毒后取一约1cm2左右的组织小块，迅速放入冰冷的已加抗生素的培养液或平衡液中，在密封的容器内尽快送到实验室。=2\*GB3②组织块运回实验室后，尽快更换抗生素溶液，尽量除去表面血污及毛发等污染物，然后将其切成小块，放置培养液中备用。3）原代培养原代培养也叫初代培养，是从供体取得组织后在体外进行的首次培养。原代培养的成功与否与样品的处理即清洗、供体年龄、操作、培养基的选择等多方面因素相关。供体年龄越小、处理样品时间越短，原代培养的成功率越高。原代培养主要包括有植块培养、分离（散）细胞培养、悬浮细胞培养和器官培养等。其中植块培养常被用于种质资源细胞库的构建中。其基本过程为：将上面取得的材料切成1mm3大小的植块，再将植块接种到培养器皿内，加入培养液，然后将培养皿放入培养箱内培养。该步的主要目的在于让植块内的细胞从植块内迁移出来并在植块外分裂增值，然后将植块移除，从而得到细胞培养物。4）传（继）代培养在植块培养物生长一定时间后，从植块内长出的细胞会越来越多，同时不断地分裂增值，逐渐长满所附着的生长基质表面，细胞之间就会逐渐发生接触性抑制现象，植块培养物就可能会停止生长。这种情况下，需要将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿内继续培养，这个过程就叫做传代。再培养主要包括清洗、消化和分瓶等步骤。清洗：弃除培养瓶内旧的培养液，用预热至37℃的0.9%NaCl液洗细胞2～3次，以除去残余的血清和脱落的组织块及死细胞。消化：向瓶内加入适量消化酶，倒置培养瓶于温箱中预热至37℃，然后翻转消化30秒。在倒置显微镜下观察，细胞质回缩，细胞间隙增大时，加入全培养液并用吸管反复轻轻吹打瓶壁细胞，使细胞脱落形成细胞悬液。分瓶：按1∶2或1∶3的比例分瓶，放入培养箱中继续培养。（3）培养细胞系的鉴定：细胞在传代培养后需对其进行检测鉴定，判断是否符合所需的各项指标。畜禽种质资源细胞库的鉴定内容主要以世界最大，最权威的细胞库——美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection，ATCC)的检测内容为标准。其检测项目有：①培养简历：组织来源日期、物种、性别、年龄、供体正常或异常健康状态、细胞已传代数等。②培养液：培养基种类和名称、血清来源和含量。③冻存液：培养基和冻存液名称。④细胞活力：冻存前后细胞成活率和生长特性。⑤细胞形态类型：上皮细胞、成纤维细胞、B淋巴细胞或其他细胞等。⑥核型：二倍体或多倍体，有无标记染色体。⑦无污染检测：无细菌、真菌、支原体、原虫和病毒等污染。⑧物种检测：检测同工酶，以证明细胞没有交叉污染。⑨免疫检测：1～—2种血清学检测。另外，中国农业科学院畜牧研究所“重要濒危畜禽品种体细胞库构建及其生物学特性研究”课题组在此基础上又添加了5个检测项目，分别为染色体带型分析：通过G带、C带、Q带和Ag-NORs的分布和数量确定细胞种源，以及通过复制带来确定性染色体；检测培养细胞在基因表达中是否履行其正常功能；培养细胞与新鲜动物组织同种同基因序列的比较研究；确定不同品种细胞的生长规律，鉴定细胞生长发育状况和培养细胞数量检测。（4）细胞系的冷冻保存：在细胞系构建成功后，需对其进行冷冻保存。其主要步骤如下：1）换液：将要冻存的细胞于冻存前24h更换新鲜培养液；2）消化：常规法消化细胞，加培养液终止反应，将同一个体的细胞收集于一培养瓶中；3）记数：红细胞计数板计数冻存细胞总数；4）收集：离心去上清液，加入4℃的冻存液,混匀后调整细胞密度为每毫升3～-4×106个细胞，用吸管轻轻吹打使细胞分散均匀；5）分装:分装入灭菌的冻存管中,严密封口，标明动物名称、性别、培养代数、冻存日期、个体编号等；6）预冻：将冻存管放入装有异丙醇的冻存盒中，置4℃20～-30min,使其充分渗透到细胞内，达到内外平衡后置于-70℃冰箱中过夜；7）冻存：提出冻存管放入液氮柜中，长期保存；（5）细胞复苏在需要使用冷冻保存的细胞时，首先得对其进行解冻处理，主要过程有：1）解冻：将冻存管从液氮中取出,迅速投入42℃水浴中，不停的晃动,见余有小冰团黄豆粒大小时放入超净工作台内；2）.加液：用吸管将细胞移入加有培养液的培养瓶中，轻轻吹打均匀，放置于培养箱中培养，过夜换液继续培养。5.可用于保存遗传资源的其他生物新技术20世纪60年代以来，细胞生物技术进入了快速发展阶段，取得了丰硕成果，一些技术已进入实用阶段。胚胎干细胞（ES细胞）是指从早期胚胎内细胞团(ICM)或桑椹胚分离和克隆的具有全能性的细胞。1981年，Evans和Kaufman首先首次分离得到小鼠ES细胞，并建立了ES细胞系。由于ES细胞具有在体外诱导分化为各种功能性细胞的特性，它被广泛应用于动物克隆、转因动物的生产、真核细胞基因的表达与调控、人类遗传病动物模型的创建，人类器官移植材料的生产以及细胞分化机制的研究等领域。ES细胞系作为一种有效的遗传资源保护方式，它可以大大地提高繁殖效率，迅速扩大濒危动物的群体数量，同时也可以采用冷冻的全能性细胞作供体进行细胞核移植克隆已经灭绝或濒临灭绝的物种，近年来已经相继在牛、羊、猪等大动物建立ES细胞系。克隆即无性繁殖、非有性繁殖或细胞核移植等技术的总称。动物克隆主要指由一个细胞或个体，以无性繁殖的方式产生具有完全相同的遗传性状的细胞群或新个体。动物克隆发展已经由胚胎克隆逐渐过渡到体细胞克隆，即核移植技术：取出一个双倍体细胞核移入一个去核的卵细胞，并在一定条件下进行核卵重组，再植入代孕母体中发育成新个体的过程。克隆可通过胚胎分割、胚胎细胞克隆、体细胞克隆三条途径来保存种质资源，1996年英国报道克隆羊“多利”成功后，先后报道了牛、猴、兔、鼠等动物克隆成功的事例，利用克隆技术可保存种群各个体的若干份数量的DNA组，结合胚胎移植技术，使与现有遗传资源相同的物种重现。此外，冷冻保存卵母细胞技术也是一种具有发展潜力的遗传资源保护方法。四、家畜遗传资源的管理与利用家畜遗传资源保护与利用工作是一项基础性、社会性、公益性工作，不仅是一项技术性很强的工作，而且涉及多部门、多学科、需要投入大量的各类人才和物力。在家畜遗传资源保护与开发方面要实现突破，有新的发展，必须统筹规划，调动各方面的积极性，采取切实可行的措施。近年来，在联合国粮农组织，有关国际组织如：联合国环境规划所（UNEP），国际稀有品种研究会（RBI）,亚太地区育种研究促进会（SABRAO）及一些国家的政府的积极努力和协调下，制定了全球和各国的家畜遗传资源管理策略。以便更好的了解、维护、开发利用和评估家畜遗传资源。家畜遗传资源的保护和利用是全球动物遗传资源保护工作中最重要的组成部分，我国是一个家畜遗传多样性特别丰富的大国，今后在该项工作中的基本路线是：立足畜禽品种资源保护，有计划地进行选育提高，面向市场开发利用，逐步形成保护和利用的良性循环，保种工作突出重点，实行分级负责。建立与国民经济和社会发展相适应的保护和管理体系，把畜禽遗传资源保护与开发推向高水平。1.家畜遗传资源的监测家畜遗传资源的管理涉及多学科、多部门，是一项庞大的系统工作，需全球各国、一个国家内各部门协调行动，制定一个科学合理的系统，畜禽遗传资源监测应包括以下内容：1）制定长远计划，2）专业队伍建设，3）融资渠道，保证经费来源，4）开展资源普查，确定重点品种，5）确定具有独特种质特性的群体和濒危群体，6）建立系统保护与利用法规，权威的执法机构，7）维护遗传资源设施、场地建设，8）建立遗传资源评估体系，=9\*GB3⑨种质和信息系统，建立资源数据库，=10\*GB3⑩制定利益共享体系、国际合作交流的能力建设，促进家畜遗传资源管理和利用的研究。要实施有效的畜禽遗传资源保护，必须掌握群体的基本情况，最主要掌握群体规模的变化，即进行有效的品种资源监测。主要的监测指标有：1）种群主要的地理分布区域，2）种群的群体规模和群体结构，3）品种种质特性变化，如：体型外貌、主要生产性能、抗病力等，4）遗传结构的变化，5）品种的现状及利用情况，1）品种的受危程度，1）中心分布区域的地理生态环境及其变化。2.家畜遗传资源数据库遗传资源处于动态的过程，为了科学合理有效地实施遗传资源的管理，从事该工作的管理者、科技人员需要及时、准确了解遗传资源的相关信息。遗传多样性管理数据库是《生物多样性公约》缔约国会议中期方案的重点工作，也是历次缔约国大会的主要议题，联合国环境规划署利用GEF资金于1995年启动了“生物多样性数据管理与信息网络化能力建设”项目（BDM）,取得了丰硕的成果，目前已建成诸多的遗传资源数据库系统。如世界保护监测中心（WCMC），生物多样性保护信息系统，国际自然保护联盟（IUCN），中国畜禽品种资源数据库，目前世界上家畜遗传资源最大的数据库是FAO的iDAD-iS。遗传多样性信息具有复杂性、数据庞大、时空性和特殊性的特点。要求信息库不仅存储量大，而且能提供空间、时间、动态的储存和分析能力，因此，要应用数据管理系统（DBMS），地理信息系统（GIS），遥感技术（RS），全球定位系统（GPS）等技术手段进行遗传多样性信息的采集和管理。（1）家畜遗传多样性信息的类型：1）生物多样性（CBD）确定的信息模型①生物多样性主要信息类型：生态系统与生境；物种和群落；已发现的对社会、科学和经济有重要价值的基因组和基因。②扩展的信息类型技术方面：包括生物多样性监测和评价技术的信息，如数据采集技术，计算机系统和通讯，遥感，地理信息系统，数据库技术和标准。生物技术及其价值与风险方面：包括有关生物技术研究和应用安全的信息交流，生物资源的价值及其传统利用的特征。环境统计学和经济学方面：包括资源利用、生物多样性价值、土地利用、利益和公平分享、自然资源的利用、贸易、经济学等方面的信息。政策方面：包括政策制定、建模、决策支持系统和技术、授权和公共咨询技术等方面的信息。人类因素方面：包括人口、健康、社会条件、土著知识以及这些与生态多样性间的相互关系。法律方面：包括环境立法、公约、议定书、法规和标准等方面的信息。2）UNEP生物多样性国情研究指南归纳的信息类型UNEP生物多样性国情研究指南（1993）阐明了较重要的信息需求，特别是对评价和战略制定较重要的几类信息。①生物信息：这是生物多样性保护的基本点—核心数据，其中包括物种、生态系统和遗传资源的数据，涉及到资源的现状和分布、功能关系以及支持该学科的工具开发。②自然条件的信息：有关自然条件，如气候、地形和水文的信息。③社会经济的信息：生物资源的利用和滥用实际上是社会经济因子的函数。重要数据有森林的监测、农业生产方法的影响，或人口中心以及交通路线的分布。自然资源的获取和利用是较重要的数据，它常常构成地方经济中一个基本组成部分。④费用和效益的信息：为了有效地管理生物多样性，必须了解生物多样性的真正价值以及管理方式的费用和效益。这就需要涉及到诸多如管理保护区系统的费用，旅游收入的水平以及流域保护的间接效益等。⑤威胁压力的信息：为了改善各种生物资源的管理，查明和监测有关生物多样性潜在和实际威胁因素，对任何信息管理项目计划皆具有重要意义，因为任何信息管理计划皆需要考虑到直接因素外的影响，以及人类活动的潜在影响。⑥持续管理的信息：生物多样性保护体现在对资源的有效和持续的管理，而评价此种管理，不仅需要生物多样性本身的信息（如现状与分布），而且还需要过去和现在的管理活动的信息，特别是生物多样性利用的信息。⑦信息源的信息：需要有关信息模型、标准、技术以及信息交流机构和专家技能等方面的信息。（2）遗传多样性保护核心数据的确定：保护生物多样性的信息需求主要集中在生态系统和生境、生物群落、基因组和基因这三个层次上。即要求查明以下的核心数据：1）拥有高度多样性、大量特有种或受威胁种的生态系统或荒野地；迁徙物种所需的生境；具有社会、经济、文化或科学重要性的生态系统；或具有代表性、独特性，或与关键重要的进化或其他生物学过程相联系的生态系统。2）受威胁的物种及其群落；驯养物种的野生亲缘种及其群落；具有医药、农业或其他经济价值的物种及群落；具有社会、科学研究或文化重要性的物种及群落。3）对社会、科学或经济具有重要意义的基因组和基因。（3）畜禽遗传资源数据库的具体内容：家养动物遗传资源多媒体数据库的主要内容包括：家养动物遗传资源种类、分布、生态、种群数量、特性特征、生产性能、保护和利用方向、预警线、种群及个体的声、像、图等信息。（4）畜禽遗传资源数据管理工具：1）硬件决定使用什么样结构的计算机来开发信息系统，在很大程度上就决定了使用什么样的软件工具来管理数据。结构通常有几种选择：=1\*GB3①独立运行的计算机；=2\*GB3②局域网，数据库软件安装在文件服务器上；=3\*GB3③客户—服务器结构；=4\*GB3④由数台计算机用专线或拨号线联结在一起构成的分布式数据库。2）软件①数据库管理系统：数据库管理系统（DBMS）通过用户自己制定的表格可以方便的输入新的记录或者修改已有的记录。数据库管理系统可以找出用户需要的记录产生输出报表，以汇总的形式提供信息。常用的数据库软件有MSAcess、FoxPro、Informix、Oracle、SQLserver等。②电子表格软件：电子表格软件指带有绘图功能的自动计算板。数字放入栅格后，它会自动进行计算，并把结果存在指定地方。常用的电子表格软件有Excel、Lotus等。③统计软件包：常用的数据计算可以用数据库或者电子表格等完成，但是