高中生物【分层作业】1.2 第2课时 微生物分离纯化和培养的无菌技术（苏教2019版选择性必修3）

第1章发酵工程第2节发酵工程的无菌技术第2课时微生物分离、纯化和培养的无菌技术必备知识基础练1.[2023江苏扬州邗江中学高二月考]某同学利用选择培养基成功分离出了土壤中的自生固氮菌，得到了如图所示的实验结果。下列说法正确的是()A.该实验使用了平板划线法接种B.该实验使用了液体培养基C.该实验使用了无碳培养基D.该实验使用了无氮培养基2.[2023江苏常州武进中学高二调研]稀释涂布平板法是常用的微生物培养方法。下列相关叙述正确的是()A.倒好的平板应立即使用，以防止培养基的表面干燥B.稀释涂布平板法不可用于微生物的分离，只可用于微生物的计数C.用此法估测的数值往往偏小，应以菌落数最多的平板计数为准D.使用过的微生物培养基应进行灭菌处理后再丢弃3.[2023江苏南通高二期末]某研究小组为调查湖水中的细菌污染情况进行了实验。下列相关叙述错误的是()A.实验用过的带菌培养基必须经消毒后才能倒掉B.用稀释涂布平板法对细菌进行分离、纯化和计数C.对照组设置可在另外培养基上接种等量无菌水D.可以根据菌落和代谢特征对细菌种类进行鉴定4.[2022江苏连云港东海高二第一次学分认定考试]下图为纯培养酵母菌的一个操作环节示意图，下列相关叙述错误的是()A.该操作步骤是接种，方法是平板划线法B.除第一次划线外，以后的每一次划线的起点都是上一次划线的末端C.图中酵母菌密度最小的是5处D.该接种方法适用于酵母菌的计数5.[2023江苏扬州高邮高三调研]已知固体培养基会因碳酸钙的存在而呈乳白色，且乳酸能分解培养基中碳酸钙。某同学用新鲜的泡菜滤液为材料进行了分离纯化乳酸菌的实验。下列叙述错误的是()A.分离纯化所用的培养基中加入碳酸钙的作用是鉴别乳酸菌B.分离纯化所用的培养基加入锥形瓶后一般还要进行灭菌处理C.分离纯化乳酸菌时，需要用无菌水对泡菜滤液进行梯度稀释D.分离纯化乳酸菌时，应挑选出不具有透明圈的菌落作为候选菌6.[2023江苏南通海安高级中学高二调研]原油中含有大量有害的、致癌的多环芳烃。土壤中有些细菌可以利用原油中的多环芳烃作为碳源，在培养基中形成分解圈。为筛选出能高效降解原油的菌株并投入除污，某小组同学设计了相关实验。下列有关实验的叙述，不正确的是()A.应配制来源于被原油污染土壤的土壤稀释液备用B.配制以多环芳烃为唯一碳源的选择培养基C.将土壤稀释液灭菌后接种到选择培养基上D.在选择培养基上能形成分解圈的可能为所需菌种7.在分离、纯化细菌的实验中，划线接种(甲)、培养结果(乙)如下图所示，a、b、c、d是划线的四个区域。下列有关叙述错误的是()A.操作过程中，接种环至少需灼烧五次B.连续划线的目的是获得单个细菌形成的菌落C.甲图中的a区域为划线的起始区域D.蘸取菌液和划线都要在酒精灯火焰旁进行8.[2023江苏无锡高三期末]在“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”探究实验中，要规范地进行无菌操作。下列与无菌操作相关的说法，正确的是()A.为了防止杂菌污染，应将配制好的选择培养基分装到培养皿中再用高压蒸汽灭菌锅进行灭菌B.将土样进行10倍稀释后，取1mL上清液加入盛有9mL蒸馏水的试管中依次等比稀释C.将涂布器在火焰上灼烧，待其上的酒精燃尽后，必须先冷却再进行涂布平板操作D.待长成的菌落稳定后，要在无菌条件下进行尿素分解菌菌落的观察和计数9.中学印刷试卷多数使用蜡纸，蜡纸的主要成分是棉花纤维和石油蜡。蜡纸成本低，但在自然环境中由于透水性差而难以降解。某课题小组尝试从土壤中筛选出能够分解石油蜡的微生物，流程如下图所示。回答下列问题：(1)下列几个地方的土壤样品中最可能筛选出目的菌的是()A.农田里 B.炼油厂附近C.食品加工厂附近 D.化肥工厂附近(2)在配制培养基时，应该以石油蜡为唯一。培养瓶和培养皿中的培养基在成分上的差异是前者缺少。

(3)研究者希望通过培养皿中的分解圈来筛选分解能力最强的微生物，结果发现其中每个圈子几乎交错一起，还有很多菌落紧挨在一起，此时应该采取的措施是。

(4)有同学提出，将培养瓶中的石油蜡换为蜡纸碎屑，希望筛选出能够同时分解石油蜡和棉花纤维的微生物，这种方法是否可行?，理由是。

关键能力提升练10.[多选][2023江苏盐城伍佑中学高三模考]下图中甲是稀释涂布平板法中的部分操作，乙是平板划线法的操作结果。下列叙述错误的是()A.甲中涂布前要将涂布器灼烧接着涂菌液B.甲、乙操作中只有甲可以用于微生物的计数C.乙中接种环需要灼烧5次D.乙中的连续划线的起点是上一次划线的末端11.[2023江苏盐城阜宁中学高三期中]野生型大肠杆菌菌株能在基本培养基上生长，氨基酸营养缺陷型突变株无法合成某种氨基酸，只能在完全培养基上生长。下图为纯化某氨基酸营养缺陷型突变株的部分流程图，①②③④代表培养基，A、B、C表示操作步骤，D、E为菌落。下列叙述错误的是()A.图中①②④为基本培养基，③为完全培养基B.A操作的目的是提高突变率，增加突变株的数量C.B的正确操作是用涂布器把菌液均匀地涂布在②表面D.经C过程原位影印及培养后，可从④中挑取D进行纯化培养12.聚羟基脂肪酸酯(PHA)是由嗜盐细菌合成的一种胞内聚酯，它具有类似于合成塑料的理化特性，且废弃后易被生物降解，可用于制造无污染的“绿色塑料”。科学家从某咸水湖中寻找生产PHA菌种的流程图如下图所示。下列说法正确的是()A.步骤②可用平板划线法接种到含合成塑料的选择培养基上B.如果用稀释涂布平板法接种，涂布时用涂布器蘸取少量菌液并均匀地涂布在培养基表面C.挑取菌落时，应挑取多个菌落并分别测定嗜盐细菌的PHA含量D.步骤④所用到的培养基应加入琼脂，以便挑取单菌落获得纯化菌株13.鞣质(单宁)是一种具有止血、杀菌等作用的中药成分，在植物中广泛分布。为探究鞣质对自然界中生存条件相同的甲、乙、丙三种细菌的杀伤能力，某科研小组将等量的甲、乙、丙三种细菌接种到含有适量鞣质的完全培养基和不含鞣质的完全培养基上，在相同且适宜的条件下培养一段时间，观察菌落大小，结果如图所示。下列相关说法不正确的是()A.实验中用的培养皿等玻璃器材，可以采用干热灭菌法灭菌B.由图中结果可知，鞣质对甲细菌的杀伤能力最强C.为排除杂菌污染，本实验设置的实验组和对照组比较合理D.接种前，可以用显微镜直接计数法判断三种细菌接种量是否相等14.[2023江苏泰州姜堰中学高三质量检测]物质W是一种含氮有机物，会污染土壤。W在培养基中达到一定量时培养基表现为不透明。某研究小组欲从土壤中筛选出能降解W的细菌(目标菌)。回答下列问题：(1)要从土壤中分离目标菌，所用选择培养基中的氮源应该是。

(2)在从土壤中分离目标菌的过程中，发现培养基上甲、乙两种细菌都能生长并形成菌落(如图所示)。如果要得到目标菌，应该选择菌落进一步纯化，选择的依据是。

(3)土壤中的某些微生物可以利用空气中的氮气作为氮源。若要设计实验进一步确定甲、乙菌能否利用空气中的氮气作为氮源，请简要写出实验思路并预期结果和结论。。

(4)该小组将人工合成的一段DNA转入大肠杆菌中，使大肠杆菌产生能降解W的酶(酶E)。为了比较酶E与天然酶降解W能力的差异，该小组拟进行如下实验，请完善相关内容。①在含有一定浓度W的固体培养基上，A处滴加酶E的缓冲液，B处滴加含有相同浓度天然酶的缓冲液，C处滴加，三处滴加量相同。

②一段时间后，测量透明圈的直径。若C处没有出现透明圈，说明；若A、B处形成的透明圈直径大小相近，说明。

学科素养创新练15.[多选][2023江苏姜堰中学、如东中学、沭阳中学高三联考]双层平板法是一种利用底层和上层均为牛肉膏蛋白胨培养基对噬菌体进行检测的常用方法。具体操作如下：先在无菌培养皿中倒入琼脂含量是2%的培养基凝固成底层平板后，将琼脂含量是1%的培养基融化并冷却至45~48℃，然后加入宿主细菌和待测噬菌体稀释悬液的混合液，充分混匀后立即倒入底层平板上形成双层平板。培养一段时间后，在上层平板上看见由于噬菌体侵染周围细菌而使宿主细胞裂解死亡形成的空斑，即噬菌斑。通常一个噬菌斑来自原液中的一个噬菌体。根据噬菌斑的数目计算原液中噬菌体的数量，如图所示。下列相关叙述正确的是()A.牛肉膏蛋白胨培养基可作为选择培养基选择出噬菌体的宿主细胞B.加入混合液后，使用灭菌后的涂布器将混合液均匀地涂布在培养基表面C.双层平板法中加了底层培养基后弥补了培养皿底面不平的缺陷D.上层培养基中琼脂浓度较低，因此形成的噬菌斑较大，更有利于计数

第2课时微生物分离、纯化和培养的无菌技术参考答案1.【答案】D【解析】该实验中将土壤浸出液接种到培养基的方法为稀释涂布平板法，所用培养基为固体培养基，A、B项错误；自生固氮微生物属于异养型微生物，没有碳源不能生长，所以为了保证自生固氮菌的生长，培养基中应添加碳源，C项错误；由于自生固氮菌可以利用空气中氮气为氮源，而其他不能固氮的微生物不能利用氮气做氮源，所以在无氮培养基上可以筛选出自生固氮菌，D项正确。2.【答案】D【解析】倒好的平板不能立即使用，通常需要进行培养检测，判断培养基灭菌是否合格，A项错误；稀释涂布平板法既可用于微生物的分离，又可用于微生物的计数，B项错误；当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，因此统计的菌落数往往比活菌的实际数目少，但在进行菌落数统计时需要统计各个平板的数据，并求得平均值，C项错误；使用过的微生物培养基应进行灭菌处理后再丢弃，避免对环境和操作者造成影响，D项正确。3.【答案】A【解析】实验用过的带菌培养基必须经灭菌后才能倒掉，以防止污染环境或感染操作人员，A项错误。4.【答案】D【解析】平板划线法只能用于微生物的分离、培养，不能用于计数，D项错误。5.【答案】D【解析】分离纯化乳酸菌时，应挑选出具有透明圈的菌落作为候选菌，D项错误。6.【答案】C【解析】在无菌环境下，将土壤稀释液接种到选择培养基上，将土壤稀释液灭菌后会杀死原有菌种，C项错误。7.【答案】C【解析】分析图乙可知，a区域出现了单个菌落，d区域菌落最多，因此a区域应该为划线的最终区域，d区域为划线的起始区域，C项错误。8.【答案】C【解析】配制好的选择培养基先用高压蒸汽灭菌锅灭菌，再在无菌环境中分装到培养皿中，A项错误；将土样进行10倍稀释后，取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中依次等比稀释，B项错误；将涂布器在火焰上灼烧，待其上的酒精燃尽后，必须先冷却再进行涂布平板操作，防止高温杀死菌种，C项正确；待长成的菌落稳定后，可直接观察，无须在无菌条件下进行尿素分解菌菌落的观察和计数，D项错误。9.【答案】(1)B(2)碳源凝固剂(3)将培养液稀释后再进行接种或缩短培养时间(4)不可行只能分解石油蜡和只能分解棉花纤维的微生物也能生长【解析】(1)根据题意可知，该课题小组尝试从土壤中筛选出能够分解石油蜡的微生物，因此实验用的土壤样品应取自炼油厂附近，以筛选目的菌，故选B。(2)本实验筛选的目的菌为能够分解石油蜡的微生物，因此在配制培养基时，应该以石油蜡为唯一碳源。培养瓶中的培养基为液体培养基，培养皿中的培养基为固体培养基，它们在成分上的差异是前者缺少凝固剂。(3)培养液浓度过高，细菌紧挨在一起，此时应该将培养液稀释后再进行接种或缩短培养时间。(4)将培养瓶中的石油蜡换为蜡纸碎屑，只能分解石油蜡和只能分解棉花纤维的微生物也能生长，不能筛选出能够同时分解石油蜡和棉花纤维的微生物。10.【答案】AC【解析】为防止杂菌污染，涂布前要将涂布器灼烧，冷却8~10s后才能进行涂布，若灼烧后立即涂布，则会将菌体杀死，A项错误。甲是稀释涂布平板法，在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个菌落，通过统计菌落数，可以推测出菌液中微生物的数量；乙是平板划线法，接种环在划线前后都要灭菌(杀死残留在接种环上的菌种)。平板划线法能用于菌种的分离、纯化，无法计数，因此只有甲可以用于微生物的计数，B项正确。乙是平板划线法，在每次划线前都要灼烧接种环，在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环，乙总共划线5次，接种环需要灼烧6次，C项错误。乙中连续划线的起点是上一次划线的末端，这样能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终得到由单个活菌繁殖而来的菌落，D项正确。11.【答案】A【解析】野生型大肠杆菌菌株能在基本培养基上生长，氨基酸营养缺陷型突变株无法合成某种氨基酸，只能在完全培养基上生长。根据题干信息和题图分析，图中①②④为完全培养基，③为基本培养基，A项错误。12.【答案】C【解析】PHA是由嗜盐细菌合成的一种胞内聚酯，要筛选嗜盐细菌，步骤②可用稀释涂布平板法接种到含盐量较高的选择培养基上，A项错误；如果用稀释涂布平板法接种，涂布时应用移液器取样至培养基上，然后用涂布器均匀涂布，B项错误；要筛选高产聚羟基脂肪酸酯(PHA)的嗜盐菌，挑取菌落时，应挑取多个菌落并分别测定嗜盐细菌的PHA含量，最后进行比较，C项正确；步骤④(扩大培养)应选用液体培养基，液体培养基中不应加入琼脂，D项错误。13.【答案】C【解析】为排除杂菌污染，本实验还需设置未接种细菌的含鞣质的完全培养基和未接种细菌的不含鞣质的完全培养基作为空白对照，C项错误。14.【答案】(1)W(2)乙乙菌落的周围出现透明圈，说明乙菌能降解W(3)将甲、乙菌分别接种在无氮源培养基上，若某细菌能生长，则说明该细菌能利用空气中的氮气作为氮源(4)①缓冲液②缓冲液不能降解W酶E与天然酶降解W的能力相近【解析】(1)该研究小组的目标菌是能够降解物质W的细菌，而物质W是一种含氮有机物，故可作为筛