高中三年级上学期生物《蛋白质工程的应用》教学课件

蛋白质工程的应用一.蛋白质工程

蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。二.蛋白质工程的实例--胰岛素的改造（一）胰岛素的发现及改造历程

胰岛素于1921年由加拿大科学家首先发现。1922年开始用于临床，使过去不治的糖尿病患者得到挽救。

1955年英国F.桑格小组测定了牛胰岛素的全部氨基酸序列，开辟了人类认识蛋白质分子化学结构的道路。

70年代初期，英国和中国的科学家又成功地用X射线衍射方法测定了猪胰岛素的立体结构。这些工作为深入研究胰岛素分子结构与功能关系奠定了基础。

1965年，中国科学家人工合成了具有全部生物活力的结晶牛胰岛素，它是第一个在实验室中用人工方法合成的蛋白质，稍后美国和联邦德国的科学家也完成了类似的工作。（一）胰岛素的发现及改造历程二.蛋白质工程的实例--胰岛素的改造第一代胰岛素-动物胰岛素

1921年弗雷德里克·班丁（FrederickBanting）与约翰·麦克劳德（JohnMacleod）合作首次成功提取到了胰岛素，不同种族哺乳动物（人、牛、羊、猪等）的胰岛素分子的氨基酸序列和结构稍有差异，其中猪胰岛素与人的最为接近。动物胰岛素是最早应用于糖尿病治疗的胰岛素注射制剂，一般是猪胰岛素，猪胰岛素与人胰岛素存在1至4个氨基酸的不同，因此容易发生免疫反应，注射部位皮下脂肪萎缩或增生，胰岛素过敏反应，并且由于其免疫原性高，容易反复发生高血糖和低血糖，容易出现胰岛素抵抗。（一）胰岛素的发现及改造历程二.蛋白质工程的实例--胰岛素的改造第二代胰岛素-人胰岛素

20世纪80年代，人们通过基因工程表达出高纯度的合成人胰岛素，其结构和人体自身分泌的胰岛素一样。

对比动物胰岛素，人胰岛素较少发生过敏反应或者胰岛素抵抗，所以皮下脂肪萎缩的现象也随之减少；由于人胰岛素抗体少，所以注射量比动物胰岛素平均减少30%；人胰岛素的稳定性高于动物胰岛素，常温25℃左右常温可保存人胰岛素4周。

在起效时间、峰值时间、作用持续时间上不能模拟生理性人胰岛素分泌模式。需在餐前30分钟注射、有较高的夜间低血糖风险。（一）胰岛素的发现及改造历程二.蛋白质工程的实例--胰岛素的改造第三代胰岛素-胰岛素类似物

20世纪90年代末,在对人胰岛素结构和成分的深入研究中发现,对肽链进行修饰:利用基因工程技术,改变胰岛素肽链上某些部位的氨基酸组合;改变等电点;增加六聚体强度;以钴离子替代锌离子;在分子中增加脂肪酸链,加大与白蛋白的结合,均有可能改变其理化和生物学特征,从而可研制出更适合人体生理需要的胰岛素类似物(insulinsimilitude)。胰岛素类似物可紧临餐使用，也称为餐时胰岛素或速效胰岛素。1、动物胰岛素：从猪和牛的胰腺中提取，两者药效相同。2、超短效：注射后15分钟起作用。

（例如门冬胰岛素、赖脯胰岛素）3、短效(速效)：注射后30分钟起作用，持续5~8小时（皮下、肌内、静注）。

（如普通胰岛素、正规胰岛素）4、中效：注射后2~4小时起效，持续24~28小时（皮下）。

（如低精蛋白锌胰岛素）5、长效：注射后4~6小时起效。

（精蛋白锌胰岛素）6、超长效：注射后3~6个小时起效，维持时间为6~24小时（皮下）。

（地特胰岛素、甘精胰岛素）7、预混：注射后0.5个小时起效，维持时间为24小时（皮下）。

（双时相胰岛素）（二）胰岛素的分类二.蛋白质工程的事例--胰岛素的改造（三）胰岛素的结构二.蛋白质工程的事例--胰岛素的改造

人胰岛素由A、B两个肽链组成。人胰岛素(InsulinHuman)A链有11种21个氨基酸，B链有15种30个氨基酸，共51个氨基酸组成。其中A7(Cys)-B7(Cys)、A20(Cys)-B19(Cys)四个半胱氨酸中的巯基形成两个二硫键，使A、B两链连接起来。此外A链中A6(Cys)与A11(Cys)之间也存在一个二硫键。（四）胰岛素的改造二.蛋白质工程的事例--胰岛素的改造1、基于胰岛素序列的改造预期蛋白质功能设计预期的蛋白质结构推测应有的氨基酸序列

找到对应的脱氧核苷酸序列

天然胰岛素容易形成二聚体或六聚体，皮下注射胰岛素后往往要经历一个逐渐解离为单体的过程，这在一定程度上延缓了疗效。

人工设计胰岛素时，希望降低胰岛素寡聚形式的稳定性，使胰岛素更快地解离，进入到循环系统中，快速达到治疗效果。生产出自然界从来没有过的蛋白质根据人类对蛋白质结构的探究，推测将B28位脯氨酸替换为天冬氨酸，或将B28的脯氨酸和B29位的赖氨酸交换位置可

合成DNA（四）胰岛素的改造二.蛋白质工程的事例--胰岛素的改造2、基于胰岛素序列的其它改造ＮＰＨ胰岛素，作用时间约持续１５～１８ｈ；进入人体内６ｈ后达到峰值，因此，它不能在睡前服用，以避免夜间低血糖的发生。开发了甘精胰岛素；甘氨酸取代Ａ２１位的天冬酰胺，２个精氨酸残基被添加到Ｂ链的Ｃ－末端，减慢了毛细血管对药物的吸收，在很大程度上降低了夜间低血糖的发生率。由于该制剂显酸性，不能与其它短效制剂混合使用，并且可能在注射期间导致疼痛。将Ｂ链的Ｃ－末端截短，消除了Ｂ３０处的苏氨酸残基，Ｂ２９处的赖氨酸被肉豆蔻基部分酰化。使其可以配制成ｐＨ中性溶液。同时用脂肪二酸替换肉豆蔻基，增强药物的稳定性，使胰岛素的生物活性在体内可持续２４ｈ。（四）胰岛素的改造二.蛋白质工程的事例--胰岛素的改造2、基于胰岛素二硫键的修饰胰岛素及其类似物进入人体后，存在潜在的问题：二硫键对某些还原剂（如硫、醇）以及二硫化物异构酶不稳定，易导致结构重排和活性丧失。基于这种情况，研究人员向胰岛素分子中引入更稳定的电子等排体，例如，用三唑、硫醚、硒醚、内酰胺等替换结构中的一个或几个二硫键，以使其具有更好的热稳定性。添加二硫键的胰岛素类似物具有更好的热稳定性和功能活性，在Ａ链的第１０个氨基酸和Ｂ链的第４个氨基酸加入一个二硫键，所得到的胰岛素类似物对胰岛素受体的亲和力增强，并且在动物（大鼠）体内的药效动力学效能显著增强。（四）胰岛素的改造3、基于胰岛素二硫键增加的改造三.其它蛋白质工程的实例干扰素（IFN）是一种广谱抗病毒剂，并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制病毒的复制；同时还可增强自然杀伤细胞（NK细胞）、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用。1、干扰素简介2、干扰素改造干扰素在体外保存相当困难将干扰素分子上的一个半胱氨酸变为丝氨酸，可保存半年。（一）、干扰素的改造（二）、单克隆抗体的改造由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，称为单克隆抗体。1、单克隆抗体简介2、单克隆抗体改造小鼠单克隆抗体会使人产生免疫反应，导致治疗效果降低将小鼠抗体上结合抗原的区域嫁接到人的抗体上，降低诱发免疫反应的强度（三）、枯草杆菌蛋白酶的改造1、枯草杆菌蛋白酶简介2、枯草杆菌蛋白酶改造迄今为止，利用蛋白质工程获得的该酶的突变体已有上百种，从中可能筛选出一些符合工业化生产需求的突变体，从而提高这种酶的使用价值。枯草杆菌蛋白酶催化水解蛋白质为氨基酸,在有机溶剂中也能催化多肽的合成。这些碱性蛋白酶具有重要的应用价值,被广泛应用于洗涤剂、制革及丝绸工业。产生这类酶的菌有地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、缓慢芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌和南极嗜冷芽孢杆菌等。蛋白质工程是一项难度很大的工程，主要是因为蛋白质发挥功能必须依赖于正确的高级结构，而这种高级结构往往十分复杂。科学家要设计