OGDCE2和BCOADAE2的二联体检测在原发性胆汁性肝硬化中的意义

1/1OGDCE2和BCOADAE2的二联体检测在原发性胆汁性肝硬化中的意义OGDCE2和BCOADAE2的二联体检测在原发性胆汁性肝硬化中的意义作者：

陈燕，娄加陶，姚定康，周晔，吴传勇，钱琤，蒋天舒，陈波，仲人前，邓安梅【摘要】目的通过重组表达抗原OGDCE2和BCOADCE2的二联体融合蛋白(B0)，并用于检测自身抗体及临床意义。

方法重组表达的融合蛋白(B0)，通过NiNTA亲和柱纯化，经过免疫印迹法(IBT)和酶链免疫吸附(ELISA)法检测56份PBC患者血清，以48份自身免疫病患者、50份其他肝病患者、70例正常人血清为对照组。

结果56例确诊的PBC患者中，42例阳性，阳性率为75．0%。

而健康体检者和疾病对照组血清中的M2抗体均为阴性。

结论通过用重组表达的二连体B0检测PBC患者血清中的M2抗体，具有一定的特异性及敏感性，为临床进一步研究PBC，辅助诊断提供一些辅助参考。

【关键词】BCOADAE2OGDCE2二联体(B0)；免疫印迹；酶联免疫吸附试验；原发性胆汁性肝硬化原发性胆汁性肝硬化(primarybiliarycirrhosis，PBC)是以进行性胆汁淤积伴有肝损伤为特点，并逐渐形成肝硬化及其并发症。

其肝组织病变特征是以淋巴细胞为主的大量炎性细胞浸润，肝内小叶间胆管的慢性非化脓性破坏性胆管炎，最终发展为肝硬化甚至肝功能不全。

血清线粒体抗体M2(AMAM2)诊断PBC的敏感性和特异性均超过90%~95%，为本病最突出的免疫学指标异常，也是重要的诊断手段[1]。

M2抗体的靶抗原主要为线粒体上的2氧酸脱氢酶复合体(2OADC)的其中一些组分：

侧链二氧酸脱氢酶复合体E2(BCOADCE2)、丙酮酸脱氢酶复合体E2(PDCE2)、2氧戊二酸脱氢酶(OGDC)[2~3]。

我们通过采用重组抗原(BCOADCE2)和2氧戊二酸脱氢酶(OGDC)的复合体BO来检测M2抗体，以利于PBC的早期诊断。

1材料和方法1．1标本来源PBC患者组56例，为本院2004年8月2006年6月间，经住院检查确诊的PBC患者。

其中女54例，男3例，男女比例为1：

18。

年龄32~65岁。

并且PBC的诊断符合2000年美国肝脏病学会(AASLD)推荐的诊断指南：

排除甲、乙、丙、戊、庚型病毒性肝炎；肝功能异常，有胆汁淤积的生化改变(主要是碱性磷酸酶、谷胺酰转肽酶升高)且无其他原因解释；血清抗线粒体抗体或M2抗体阳性，同时AMA1：

40[4]。

患者并行穿刺病理检查，汇管区有大量淋巴细胞、嗜酸粒细胞聚集，光镜下可见小叶结构完整，实质内可见凋亡小体形成及散在点状坏死，均符合PBC早期病理学特征。

70例正常对照均为本院的健康体检者，50例其他肝病患者和自身免疫病患者48例(类风湿性关节炎15例，系统性红斑狼疮20例，强直性脊柱炎3例，自身免疫性胆管炎10例)为疾病对照组，均为本院住院患者。

1．2纯化重组抗原将特异性扩增OGDCE2和BCOADCE2的二联体BOcDNA定向插入高效表达载体PET28a(+)，转导入宿主菌大肠埃希菌(E．coli)．BL21，经异丙基硫代D半乳糖苷(IPTG)诱导后表达，在变性条件下用带6个组氨酸的NiNTA琼脂糖纯化，获得高纯度的重组BO，方法参见文献[5]。

1．3利用重组融合抗原IBT检测M2抗体将重组蛋白BO经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)电泳后，转印至硝酸纤维素(NC)膜，封闭后依次加入血清、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人IgG，显色剂3．3二氨基联苯胺四盐酸盐底物和H2O2，观察反应条带。

同时用正常人血清作阴性对照。

1．4ELISA法检测M2抗体ELISA方法检测PBC患者，健康体检者和疾病对照组血清中的M2抗体。

纯化后的重组蛋白，用碳酸盐缓冲液CBS(pH9．5)稀释后分别包被酶标板。

OP为4mg/L，4℃过夜(16h)，吐温-20碳酸盐缓冲液洗涤3次后，加入小牛血清封闭，洗涤后依次加入待检血清、辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG、显色剂3．3二氨基联苯胺和H2O2，经酶标比色仪吸光度450nm比色，读取吸光度值，判定值为阴性对照A值+5倍标准差。

15统计学处理用StlJderlts检验分析均值间差异。

第2期OGDCE2和BCOADAE2的二联体检测在原发性胆汁性肝硬化中的意义陈燕，等2结果2．1免疫印迹检测结果用重组融合抗原BO经IBT检测，56例确诊的PBC阳性病人，检测出抗BO抗体阳性的为42例，阴性14例。

正常对照和其他非胆汁性肝硬化患者抗BO抗体均为阴性。

48例自身免疫病患者中，10位自身免疫性胆管炎患者中2例AMA阳性；但其血清中抗BO抗体均为阴性。

结果见表1。

表1抗BO抗体与AMA抗体检测结果(略)22常规方法检测采用常规方法检测，自身免疫病患者和其他肝病患者、健康对照者中M2抗体均为阴性。

而56例确诊的PBC患者中，其M2抗体为阳性42例，阴性14例；与我们采用的IBT法和ELISA法检测结果完全符合。

23ELISA法检测抗BO血清用ELISA法检测时，正常对照组值为(8935)U，因此以gt;289U(5s)为阳性标准，lt;289U为阴性标准。

结果显示，在56例确诊的PBC患者中42例阳性，14例阴性；其他疾病对照组和健康体检者均为阴性。

3讨论原发性胆汁性肝硬化(PBC)的特征是血中线粒体抗体为阳性，而高滴度的抗线粒体抗体(AMA)是PBC的重要血清学指标。

根据其靶抗原不同，AMA可分为M1~M9共9个亚型，其中M2对PBC的诊断最具特异性。

PBC在任何年龄段均可发病，其中90%~95%为女性，大部分集中在30~70岁之间，儿童少见[6]。

AMA对PBC具有诊断意义。

95%~98%的患者AMA阳性，因此抗体出现可早于临床表现多年，所以具有早期诊断价值。

近年来研究显示，M2亚型对PBC具有较高的特异性和诊断价值。

PBC的发病率在我国鲜见报道，近年来国外报道PBC也呈上升趋势。

1987年以来鉴定出M2靶抗原为线粒体上的2氧酸脱氢酶复合体(2OADC)的一些组分：

丙酮酸脱氢酶(PDC)、2氧酸脱氢酶(BCOADC)、2氧戊二酸脱氢酶(OGDC)等，BCOADC和OGDC的抗原表位位于内酯酰区。

在PBC患者血清中OGDC的阳性率为39%~88%，而BCOADC的阳性率为53%~55%[4~7]。

我们采用重组表达的BCOADCE2和OGDCE2的二联体BO，作为靶抗原来检测PBC患者血清中的M2抗体。

56例PBC患者检查出BO抗体阳性42例，阴性的12例，其阳性率为75．0%。

自身免疫病患者、其他肝病患者和健康体检者血清中均未检测出BO抗体。

通过早期检测M2抗体，有助于早期确诊PBC患者，对指导治疗有一定参考价值。

【参考文献】\[1\]王芸,范红,郭强.原发性胆汁性肝硬化与抗线粒体抗体M2检测的临床意义\[J\].中华现代内科学杂志,2005,2(3):211-222.\[2\]VandeWaterJ,GersbwonME,LeungP,etal.Theautoepitopeofthe74kDmotochondrialautoantigenofprimarybiliarycirrhosiscorrespondstothefunctionalsiteofdibydrolipoamideacetyltransferase\[J\].JExpMed,1988,167:1791-1799.\[3\]JophnRE,NeubergerJM.Immmuopathologyofprimarybiliarycirrhosis\[J\].EnrJGastroenterolHepatol,1999,11:587-593.\[4\]NakanoT,InoueK,HiroharaJ,etal.Longtermprognosisofprimarybiliarycirrosis(PBC)inJapanandanalysisofthefactorsofstageprogressioninasymptomaticPBC(PBC)\[J\].HepatolRes,2002,22(2):250-260.\[5\]夏睛,仲人前,邓安梅,等.胰腺癌相关自身抗原47原核表达、纯化及其抗体检测胰腺癌的价值初探\[J\].中华检验医