GB∕T 19495.4-2018 转基因产品检测 实时荧光定性聚合酶链式反应（PCR）检测方法

代替GB/T19495.4—2004国家市场监督管理总局I—-GB/T19495.1转基因产品检测通用要求和定义； ——GB/T19495.6转基因产品检测基因芯片检测方法； ——GB/T19495.9转基因产品检测植物产品液本部分为GB/T19495的第4部分。1GB/T19495的本部分规定了植物及其加工产品中转基因成分筛选和品系检测实时荧光定性聚合GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求GB/T19495.7转基因产品检测抽样和制样方法GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测转基因transgene实时荧光聚合酶链式反应。在聚合酶链式反应体系中加入荧光2利用生物工程技术转入的其他生物基因。每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。3.2缩略语下列缩略语适用于本文件。bp:碱基对(basepat)CP4-EPSPS:农根菌C蛋白基因和5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因(AgrobasteriumtumefaciensstrainCP4Prodya:herhictidetolerantformof5-enolCryIA(c):苏云晶芽孢杆菌杀虫蛋白CryIA(c)基因[Bacillusthurtngierisis(Bt)subsp.Cry3A:苏云晶芽孢杆菌杀重蛋自Cr8A基因BaillisthatugiensisCBt)sbsp.TenebrionisCTAB十六烷基三甲基溴化铵(tyltrithylammonjotbromieDNA:脱氧核糖核酸(deoxyilbonucleicadATP脱氧腺苷三磷酸(deoxgadenosiretrighosphatedCTP脱氧胞苷三磷酸Cdooxgoyfdinetrphosphate)dGTP:脱氧喜苷三磷酸(deoxygusnosinetriphospkate)dNTP:脱氧核苷三磷酸(deoxyrbonucleoscaihospladUTP:脱氧尿音三磷酸(deoxyuridnetphosphatoEPSPS:5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因(5GOX:草甘膦氧化还原酶基因(glyphosateoxidoreductasegehe)LAT52:花粉特异蛋白LAT52基因Lectin:植物凝集素基因NPTⅡ:新霉素-3'-磷酸转移酶基因(neomycin-3'-phosphotransferasegene)PAT:草丁膦乙酰转移酶基因(phosphinothricinacetyltransferasegene)PLD:磷脂酶D家族基因(phospholipaseDfamilygene)PMI:6-磷酸甘露糖异构酶基因(phosphomannose-isomerasegene)pCaMV35S:花椰菜花叶病毒35S启动子(35Spromoterfromcauliflowermosaicvirus)pFMV35S:玄参花叶病毒35S启动子(35SpromoterfromamodifiepNOS:来源于农杆菌的胭脂碱合成酶基因启动子(promoterofnopalinesynthasegenefrom3tg7:谷氨酰胺转移酶7基因(transglutUGPase:马铃薯UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(UDP-glucosepyrophosphorylasegenefromzSSⅡb:玉米淀粉合成酶b亚基[theendosper4为TaqDNA聚合酶(5U/pL)荧光校正试剂(50×,使用时稀释至1×)根据需薯检测的转基因植物品系，参照阴录日中表B工的序列合成引物和探针加超纯水配制成按照GB/Tn495.7中规定的方法执行6.2样品DNA的提取与纯化按照GB/Tn94938的方法或采用具有相同效果的植物基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取。每个样品应制备2个测词样品提取DNA(提取平行重复)。6.3DNA浓度测定和定量按照GB/T19495.3中规定的方法6.4实时荧光PCR检测表1转基因筛选检测基因选用物种选用基因大豆及其加工品内源基因，pCaMV35S,pFMV35S,tNOS,BAR,PAT,GOX,CP4-EPSPS,CTP2-CP4-玉米及其加工品内源基因，pCaMV35S,pFMV35S,tNOEPSPS,Cry3A,tCaMV35S,PMI,CryIA(b),CRYIA(c),pRice5表1(续)物种选用基因油菜及其加工品内源基因，pCaMV35S,pFMV35S,tNOS,NEPSPS,pNOS,pSSuAra,pTA29,tCaMV35S,tE9,t水稻及其加工品内源基因，pCaMV35S,tNOS,BAR,CryIA(b),CRYIA(c)棉花及其加工品内源基因，pCaMV35S,pFMV35S,tNOS,NPTⅡ,BAR,PAT,CP4-EPSPS,pUbi,tE9,马铃薯及其加工品亚麻及其加工品内源基因，pCaMV35S,pFMV35S,tNOS,NPTⅡ甜菜及其加工品内源基因，pCaMV35S,pFMV35S,tN苜蓿及其加工品内源基因，pFMV35S,CTP2-CP4-EPSPS,tE9pCaMV35S,pFMV35S,tNOS,CP小麦pCaMV35S,pFMV35S,tNOS,CP6.4.2实时荧光PCR反应体系实时荧光PCR反应体系配制见表2。每个样品设置2个平行重复。10×PCR缓冲液dNTP(含dUTP)见表A.1、表B.1下游引物见表A.1、表B.1见表A.1、表B.16表2(续)终浓度注1:可选用含有PCR缓冲液、MgCl₂、dNTP和Tag酶等成分的基于Taqman探针的实时荧光PCR预混液进行实时荧光PCR扩增。注2:ROX荧光试剂仅在具有ROX校正通道的实时荧光PCR仪上进行扩增时添加，否则用超纯水补注3:反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进6.4.3实时荧光PCR反应程序将PCR反应管或反应板放入实时荧光PCR仪后，设置PCR反应荧光信号收集条件，应与探针标应的空白对照(以双蒸水代替DNA模板)。——阴性对照：内源基因检测Ct值≤30,转化事件特异性检测Ct值≥40;7.2结果判定测试样品外源基因检测Ct值≥40,内源基因检测Ct值≤30,则可判定该样品不含所检基因或测试样品外源基因检测Ct值≤35,内源基因检测Ct值≤30,判定该样品含有所检基因或品系。测试样品外源基因检测Ct值在35～40,应调整模板浓度，重做实时荧光PCR。再次扩增后的外源基因检测Ct值仍在35～40,则可判定为该样品含有所检基因或品系。再次扩增后的外源基因检测Ct7检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403和GB/T19495.2中的规定执行。各基因片段的实时荧光PCR扩增的最低检出限(LOD)为0.01%。8基因/品系名称引物/探针序列(5'-3')产物大小适用范围1F植物内源基因RPFAM-tgcgcgcctgctgccttcct2F油菜内源基因RPFAM-cggagccactcggtgccgcaactt3FRPFAM-agtccttatgtgctccactttctggtgca4F玉米内源基因RPFAM-aatcagggctcattttctcgctcctca5FRPFAM-agcaaagtcagagcgctgcaatgca-6F大豆内源基因RPFAM-ccctcgtctcttggtcgcgccctct7FRPFAM-ccacaaacacatgcaggttatcttgg8F番茄内源基因RPFAM-ctctttgcagtcctcccttgggct9F水稻内源基因RPFAM-tecgagccgtecgtgcgtc9基因/品系名称引物/探针序列(5'-3')产物大小适用范围F水稻内源基因RPFAM-tgttgtgctgccaatgtggcctgFRPFAM-tgttgtgctgccaatgtggcctgF马铃薯内源基因RPFAM-ctaccaccattacctcgcacctcctcaFagtttgtaggttttgatgt棉花内源基因RPFAM-aaacataaaataatgggaacaaccatgacatgtF甜菜内源基因RPFAM-ctacgaagtttaaagtatgtgccgctcF小麦属内源基因RPFAM-ttcccgcagccccaacaaccgcF小麦种内源基因RPFAM-caaggcggccgaaataagtF苜蓿内源基因RPFAM-tgaatgctcctgtgatctgcccatgc-F木瓜内源基因RPFAM-ttcccttcatccattcccactcttgagaF水稻、番茄、马外源筛选基因RPFAM-caaagatggacccccacccacg表A.1(续)基因/品系名称引物/探针序列(5'-3)产物大小适用范围F转基因大豆、油和苜蓿等筛选检测RPFAM-tgaaagtaatcttgtcaacatcgagcagctggF瓜等筛选检测RPFAM-catcgcaagaccggcaacaggF番茄、马铃薯、检测RPFAM-cacccagccggccacagtcgatFRPFAM-ccgagccgcaggaaccgcaggagF转基因油菜、检测RPFAM-tggccgcggtttgtgatatcgttaaF检测RPFAM-tgctcacgttctctacactcgcgctcgF麦等筛选检测RPFAM-tcatgttcggcggtctcgcgF转基因玉米、检测RPFAM-acctatgctcaagctgccaacacccF转基因油菜、马铃薯RPFAM-cgcaataatggtttctgacgtatgtgcttagc引物/探针序列(5'-3')产物大小适用范围F内源基因RPFAM-ccttatcggcttgaaccgctggaataaF转基因油菜、对烟草是内源基因RPFAM-agtccagccacccaccttatgcaagtcF转基因棉花、对玉米是内源基因RPFAM-cgtcgacgagtctaacggacaccaacF转基因玉米、RPFAM-aaaccctataagaaccctaattccttatctgggaF基因RPFRPFAM-tcttattcaaatttcaaaagtgccccagggFatgcaagtttaaattcagaaRatgtattacacataatatcgcPFRPFAM-tgccgccaacgaatcaccggF筛选基因RPFAM-ccgccgcgagctgaccctgaccgtgF任选其一，转基因水稻、玉米、棉花RPFAM-acatgaacagcgccttgaccacagcFRPFAM-tcccgaactatgactccagaacctaccctatcc表A.1(续)引物/探针序列(5'-3')产物大小适用范围F对大米是内源基因RPFRPFAM-cacgccgtggaaacagaagacatgacc转基因植物品系特异性检测用引物探针序列见表B.1。品系名称引物/探钍序列(5'-3')终浓度产物大小FuatlcaaaataagatcatacataRPFAM-cctttccatttggg-MGBFRPRPM章bigtcataccgtcatggtgt-TAMRRPFAM-tgacacaaatgatttcatacaaaagtcgagaFkPFAMhstagagateegtcaacatggtggagcacTAFRPFAM-tcagtgtttgacacacacactaagcgtgccFaacagaagtttccgttgagRPFAM-tttggggaagctgtcccatgcccFRPFAM-aagagactcagggtgttgttatcactgcgg品系名称引物/探针序列(5'-3)终浓度产物大小FRPFAM-cccggacatgaagccattacaattgacFRPFAM-aatgtggttcatccgtctt-FRPFAM-tcccggacttagctcaaaatgcatgtaFRPFAM-tttctcaacagcaggtgggtccgggtFaagagataacaggatccacPFAM-tggtaccacgcgacacacttccactcFRPFAM-ttccatgaccaaaatcccttaacgtgagtFRPFAM-agcaaccagatcggccgacaccFRPFAM-aacatcctttgccattgcccagcFRPFAM-tgaacacccatccgaacaagtagggtcaFRPFAM-tcattgagtcgttecgccattgtcgFRPFAM-gtcgacctgcaggcatgcaaggaattccatt表B.1(续)品系名称引物/探针序列(5'-3')终浓度产物大小FRPFAM-taactcaaggccctcactccgFRPFAMtttaaactgaaggCgggaaacgacaaRPFAM-aggcgggaaacgacaatctgatcatgFRBFAMacgeIgag中ctg工AMRAF0pFAM-cgagcggtatggg5F0FRPFAM-tcccgccttcagtttaaacagagtcgggtRPFAM-ctctatcgatccceetetttgatagttaanct-TFRPFAM-tctagacaattcagtacattaaaaacgtccgccaFRPFAM-cgtagctaaccttcattgtattccgFRPFAM-agggagtatgtagataaatttcaaagcgttagacggc品系名称引物/探针序列(5'-3′)产物大小FRPFAM-ttgtccctccacttcttctc-FRPFAM-atcagattgtcgttcccgccttcagtt-FRPFAM-ccgctctagaactagtggatctgcactgaa-FRPFAM-aactatcagtgttgactacat-MFRPFAM-cttaacagtactcggccgtcgaccgc-FRPFAM-ctccatggcgatcgctacgttctagaatt-FRFAM-ttgggttaataaagtcagattagagggagacaa-FaaatattaacaatgcattgRPFAM-tactcattgctgatccatgtagattcccg-FRPFAM-tcgcgcgcggtgtcatctatctc-FRPFAM-cctgcaggtcgacggccgagtac-FRPFAM-atctgcccagcactcgtccg-品系名称引物/探针序列(5'-3')产物大小FR