胎牛血清中碱性磷酸酶的测定 荧光分光光度法征求意见稿

2T/SHAIAXXXX—XXXX胎牛血清中碱性磷酸酶的测定荧光分光光度法本文件规定了胎牛血清中碱性磷酸酶物质含量的荧光分光光度测定方法。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法。3原理基于稀土/核苷酸配位聚合物独特的光学性质以及固有良好的生物相容性，制备得到荧光检测试剂CIP@SiO2-Ce/ATP-Tris。荧光试剂在295nm的激发波长下，产生363nm和435nm的荧光信号，当荧光试剂加入ALP，进行孵育后，363nm处荧光猝灭，435nm处荧光保持稳定，通过I435/I363荧光强度的比值测定ALP的含量。4仪器设备4.1荧光分光光度计：激发波长220-730nm；发射波长220-900nm。4.2分析天平：感量0.01mg和0.1mg。4.3pH计：精度±0.05。4.4离心机：离心力≥8000g。4.5恒温水浴锅：能保持（37±0.5）℃。5试剂和材料除非另有说明，分析时均使用符合国家标准的分析纯试剂，实验用水为蒸馏水或去离子水。5.1硝酸铈。5.2正硅酸乙酯（TEOS）。5.3无水乙醇。5.4浓氨水。5.5三磷酸腺苷（ATP）。5.6三羟甲基氨基甲烷（Tris）。3T/SHAIAXXXX—XXXX5.7环丙沙星（CIP）。6分析步骤6.1荧光检测试剂CIP@SiO2-Ce/ATP-Tris的制备取环丙沙星溶于无水乙醇，去离子水，浓氨水（160mL：40mL:1.5mL）的混合溶液中，得到50molL-1的混合溶液，室温下超声30min，得到透明状液体。然后逐滴加入0.4mL正硅酸乙酯，室温下机械搅拌过夜。反应结束后，离心收集，依次用无水乙醇和去离子水洗涤，得到CIP@SiO2试剂，用3mL去离子水分散，待用。配置0.25molL-1的硝酸铈水溶液和0.125molL-1的ATP的Tris-HCl溶液（50mM，pH=7.1）,取2mLCIP@SiO2分散液，磁力搅拌下加入8.3mLATP溶液，搅拌5min后逐滴加入16.7mL硝酸铈水溶液室温下继续搅拌60min。离心收集，用去离子水洗涤，得到荧光试剂，用3mL去离子水分散，于4℃的冰箱中保存待用。6.2碱性磷酸酶ALP标准溶液的配制及标准曲线的建立。分别量取6.1中荧光检测试剂溶液于13组5mL离心管中，分别加入100μL不同浓度的ALP溶液，ALP的Tris-HCl缓冲溶液至3mL，37℃孵育60min，在激发波长为295nm，发射波长为363nm和435nm条件下，使用1cm石英荧光比色皿，测量荧光强度，以碱性磷酸酶浓度（U/L）为横坐标，以荧光强度比值I435/I363为纵坐标，建立标准曲线。6.3荧光检测试剂CIP@SiO2-Ce/ATP-Tris对胎牛血清样品中ALP的荧光检测将胎牛血清样品用Tris-HCl缓冲液稀释至100倍，然后按照标准曲线建立的相同步骤进行荧光检测。7检出限在0.1-20U/L线性范围内，方法检出限0.0025U/L。8测量结果胎牛血清中碱性磷酸酶的单位浓度c（U/L）按照公式（1）计算：（1）式中：c──胎牛血清中碱性磷酸酶单位浓度，U/L；A──试样的I435/I363荧光强度比值；a──标准曲线的截距；b──标准曲线的斜率；n──胎牛血清样品的稀释倍数。9重复性每个样品平行测量三次；通过标准加入法对胎牛血清样品中的ALP进行了测量。如附表1所示，胎牛血清样品中ALP的回收率为96.75-104.2%，相对标准偏差小于3.0%。4T/SHAIAXXXX—XXXX型号LS-55(美国PerkinElmer公司)仪器测试条件A.1测试条件如下：工作参数a）激发波长：295nm；b）发射波长：363nm和435nm；c）