GB∕ T 40447-2021 鸭茅蜜穗病菌检疫鉴定方法（正式版）

国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会IGB/T40447—2021本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。大学。1GB/T40447—2021鸭茅蜜穗病菌检疫鉴定方法本文件描述了鸭茅蜜穗病菌的症状观察、分离培养及分子生物学等检疫鉴定方法。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样方法本文件没有需要界定的术语和定义。Krasil'nikov1949;Agrobacteriumrathayi(Smith1913)Savulescu1947;Corynebacteriumrathayi(Smith1913)Dowson1942;Erwiniarathayi(Smith1913)Grametal.1929;Phytomonasrathayi(Smith1913)Bergeyetal.1923;Bacteriumrathayi(Smith1913)Aujeszky1914;AplanobacterrathayiSmith1913。分类地位：病菌属细菌域Bacteria,放线菌门Actinobacteria,放线菌纲Actinobacteria,放线菌目Actinomycetales,微杆菌科Microbacteriaceae,拉氏杆菌属Rathayibacter。鸭茅蜜穗病菌的其他基本信息参见附录A。5方法原理根据鸭茅蜜穗病菌的为害症状、培养性状和生理生化特性对病原菌进行分离培养及致病性测试，根据鸭茅蜜穗病菌的特异性DNA序列进行分子生物学检测。生物鉴定系统等。2GB/T40447—20217主要试剂70%乙醇，1%次氯酸钠，生理盐水，3%氢氧化钾(KOH)。BHI、BHIA和D2NAX培养基配方按照附录B执行。实时荧光PCR检测试剂按照附录C的C.1、C.2执行。8检疫鉴定流程检测样品的鸭茅蜜穗病菌检疫鉴定步骤按图1进行。检测样品检测样品阳性阴性阳性阴性阳性阴性致病性测试阳性未检出9检疫鉴定方法现场检疫中，如植株样品发现疑似症状(参见A.4),取样带回实验室作进一步显微镜检查和病菌分离鉴定。种子样品进行隔离种植观察或病菌直接分离鉴定。取样方法按照SN/T2122执行。取种子样品100g,置于1%次氯酸钠溶液中表面消毒10min;无菌水洗涤3次后加入200mL无菌浸出液。可取部分浸出液离心沉淀提取DNA进行PCR初检，部分浸出液用于分离培养。3GB/T40447—2021疑似菌落培养3d～5d后转移至BHI平板上培养2d～3d进行纯化，纯化3次后进行实时荧光取病健交界处植株组织，切成5mm×5mm小块，70%乙醇表面消毒60s,无菌水清洗3次后移至淀提取DNA,进行PCR初检，部分组织处理液在D2ANX平板上划线分离，划线5个～10个平板，3次后进行实时荧光PCR、生理生化鉴定等后续试验。9.3实时荧光PCR检测疑似分离物纯化后提取DNA,进行实时荧光PCR检测，检测方法疑似分离物用革兰氏染色法或KOH反应法进行革兰氏阴阳性判定。取3%KOH溶液1滴，滴在用BIOLOG鉴定系统(GENⅢ)或细菌微量生化鉴定管对上述判定为革兰氏阳性的疑似分离物进行相关生理生化指标测定。疑似分离物转移至BHI平板上26℃培养2d,取菌落用无菌水配成10⁸CFU/mL菌悬液，针刺法接种5株～10株寄主幼苗叶片，接种后放置于26℃~28℃光照培养箱中，在相对湿度80%,光暗比例为16:8的条件下培养，7d后观察是否有症状产生。阳性分离物接种后，植物可在2周内出现典型症按9.2分离到的疑似分离物在培养基上的菌落特征符合9.2.2特征，生理生化特征符合9.4阳性，实时荧光PCR检测结果符合C.2.4阳性判定，且致病性测试为阳性时，判定为检出鸭茅蜜穗病菌。否则判定为未检出鸭茅蜜穗病菌。11样品及检测结果保存阳性样品经登记和经手人签字后妥善保存6个月以上。保存期满后应经高压灭菌后方可处理。4GB/T40447—202111.2菌株保存与处理分离并鉴定为鸭茅蜜穗病菌菌株，应妥善保存。可用甘油冷冻保存法或冻干保存法保存。对不需要长期保存的其他菌株应及时灭菌处理。5GB/T40447—2021(资料性)鸭茅蜜穗病菌其他信息A.1分布A.2寄主范围自然寄主是鸭茅草(Dactylisglamerata)、狗芽根草(Cynodondactylon)、多花黑麦草(Loliummultiflorum)、瑞士黑麦草(L.rigidum)、黑麦(Secalecereale);利用人工接种可侵染小麦属植物，普通小麦(Triticumaestivum)、二粒小麦(T.dicoccum)、硬小麦(T.durum)A.3生物学特性养，氧化型代谢，接触酶阳性。对营养要求苛刻，需氨基酸。菌株适宜生长温度为24℃~28℃。最高生长温度29℃~32℃,最高耐盐力3%。在大多数培养基上生长缓慢且弱，菌落圆形、全缘、光滑、凸A.4侵染循环病菌可在种子内越冬，潜伏期较长，通常可存活8个月以上，翌年播种后，侵染幼苗。病菌由气孔及其他孔口侵入，也可通过伤口和根部侵入。寄主全部生长期内病菌均可感染，以幼苗最易感病，幼苗感统阻塞，造成寄主生长衰弱。有时植株上部，特别是花序，会产生黄色细菌黏液，出现菌瘿或流胶现象。穗和种子上可见橙黄色黏性物。该病菌在鸭茅草上的为害症状见图A.1。图A.1鸭茅草上为害症状(来源：/bpp/Plant_Clinic/images/orchardgrass,%20bacterialheadblight.jpg/bpp/Plant_Clinic/images/orchardgrass,%20bacterialheadblight4.jpg)6GB/T40447—2021A.5传播方式病菌主要通过带菌种子随国际贸易进行远距离传播；小麦粒线虫可作为传播媒介。77(规范性)培养基配方B.1脑心浸出液肉汤(BHI)胰蛋白胨10.0g;氯化钠5.0g;磷酸氢二钠(12H₂O)2.5g;葡萄糖2.0g;牛心浸出液500mL;15g～20g;pH值调至7.4±0.2,121℃高压灭菌15min。B.3D2NAX培养基酵母膏2.0g;酪蛋白水解物4.0g;葡萄糖10.0g;硫酸镁(7H₂O)0.3g;氯化铵1.0g;Trizma碱1.2g;琼脂18g;蒸馏水1000mL,121℃高压灭菌15min后，冷却到58(规范性)C.1DNA提取菌悬液12000r/min离心5min,弃上清。沉淀中加入TE缓冲液20mg/mL蛋白酶K30μL,混匀，37℃水浴孵育1h。加入等体积的三氯甲烷-异戊醇(24:1),混匀。12000r/min离心5min,将上清液移至一个新离心管中。加入等体积酚-三氯甲烷-异戊醇(25:24:1),混匀，12000r/min离心5min,将上清液移至一新离心管。加入0.6倍体积的异丙醇，轻轻混匀，C.2实时荧光PCR检测表C.1引物和探针序列名称引物/探针序列(5'-3′)引物Rr-Fcctatgcgaacacgatcaaca引物Rr-RggttctcgtccttctccctgaFAM-cctcgctggtcaaccgttacg-TAMRAC.2.2PCR反应体系反应体系(表C.2)应先在试剂准备间进行PCR反应体系的配制和分装，然后移至加样间顺次加入阴性对照、样品、阳性对照的模板DNA溶液和水(试剂空白),以防止DNA模板的交叉污染。表C.2实时荧光PCR反应体系试剂名称反应体系/μLMIXbuffer探针(10pmol/μL)正向引物(20pmol/μL)反向引物(20pmol/μL)ddH₂O9GB/T40447—2021C.2.3反应参数注：可根据不同仪器/试剂盒要求将反应参数作适当调整。量2倍～10倍再次测试，出现典型扩增曲线，且Ct值≤35,判定为阳性；其余情况判定为GB/T40447—2021[1]AldermanSC,OcambCM,MellbyeME.QuantitativeassessmentofAnguinasp.andRathayibacterrathayiinDactylisglomerataseedproductionfieldsinOregonandestimatesofyieldloss.PlantDisease,2005,89(12):1313-1316.Applied&.EnvironmentalMicrobiolo[3]MurrayTD,SchroederBK,SchneiderWL,etal.RathayibactRathayibacterspeciesinducingBacterialHeadBlightofGrassesandthePotentialforLivestockPoi-sonings.Phytopatholog[4]Rathayibacterrathayi.2002./taxon/CORBRAnov.,nom.rev.isolatedfromwesternwheatgrass(Pascopyrums