第十四单元基因工程（学案）-2024年高考生物一轮复习单元整体学案（人教版2019）

第十四单元基因工程

第46讲重组DNA技术的基本工具

【学习目标】

1.概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来

的。

2.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基

本工具。

3.DNA的提取和鉴定。

【模型构建】

【自主学习】

-基础理论和技术的发展催生了基因工程

1.基因工程概念

(1)操作环境：生物体外。

(2)操作水平：DNA分子水平.

(3)主要技术：体外DNA重组和转基因等技术。

(4)操作结果：赋予生物新的遗传特姓，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产

品。

(5)育种原理：基因重组。

2.基因工程的诞生和发展(摘要)

(1)1953年，沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型并提出了遗传物质自我复制的假

说。

(2)1970年，在细菌体内发现了第一个限制性内切核酸醐(简称限制酶),后来又发现了多

种限制酶、DNA连接酶等。

(3)1972年，伯格首先在体外进行DNA改造，并成功地构建了第一个体外重组DNA分

子。

(4)1983年，科学家采用农杆菌转化法培育了世界上第一例转基因烟草。

(5)1984年，我国科学家朱作言领导的团队培育了世界上第一条转基因鱼。

(6)基因工程是在生物化学、分子生物学和微生物学等学科的基础上发展起来的。

二基因工程的基本工具

1.限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)——“分子手术刀”

(1)来源：主要来自原核牛.物。

(2)特点：具有专一性。

(3)功能：识别双卷DNA分子的特定核昔酸序列,并且使每一条链中特定部位的磷酸二

酯键断开。

(4)作用结果：当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开时，

产生的是黏性末端:当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。

2.DNA连接酶——“分子缝合针”

(1)种类

种类

比较项目

E.coliDNA连接酶T4DNA连接前

来源大肠杆菌T4噬菌体

既可以“缝合”双链DNA片段

只能“缝合”具有互补黏性末

特点互补的黏性末端,又可以“缝

躺的双链DNA片段

合”双链DNA片段的平末端

(2)功能：将双链DNA片段“缝合”起来，恢一被限制酶切开的磷酸二片键。

3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”

(1)种类：通常用质粒作为载体,另外还有噬菌体和动植物病毒等。

(2)作用

①将外源基因送入受体细胞。

②在受体细胞内对目的基因进行大量复制。

(3)必备条件

①质粒DNA分子上有一个至多个限制酶切割位点,供外源DNA片段(基因)插入其中。

②能在细在中讲行自我复制,或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。

③在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上经过人工改造

的，这些质粒上常有特殊的标记基因,其作用是便于重组DNA分子的筛选。

④对受体细胞无害。

三DNA的粗提取与鉴定

1.实验原理

(1)提取思路：DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用

这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。

(2)DNA的性质：利用DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，可初步分离DNA与

蛋白质；DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同,它能溶于ZjHOl/L的NaCl溶液。

(3)DNA的鉴定：在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色,因此二苯胺试剂可以

作为鉴定DNA的试剂。

2.材料选择

富含DNA的材料，如新鲜洋葱(也可以选择香蕉、菠菜、菜花或猪肝等)。

注意：不选择哺乳动物的血液为材料来提取DNA,因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细

胞核和线粒体等，DNA含量太少。

3-方法步骤

(1)研磨：取30g洋葱，切碎，放入研钵中，倒入10mL研磨液,充分研磨。

(2)除杂：漏斗中垫上纱布过滤后，在4℃冰箱中静置后取上清液,1500r/min的转速下

离心5min,取上清液。

(3)提取：加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%),溶液出现的白色丝状物

是DNA。

方法一：用玻璃棒沿一个方向搅拌,卷起丝状物，用滤纸吸去上面的水分。

方法二：10000r/min的转速下离心5min,取沉淀物晾干。

(4)鉴定DNA

试管编号A管(对照组)B管(实验组)

步骤1加入2mol/L的NaCl溶液5mL

步骤2不进行任何处理加丝状物或沉淀物

步骤3加4mL二苯胺试剂,混匀

步骤4沸水浴5min

实验现象溶液不变蓝色溶液逐渐变为蓝色

实验结论DNA在沸水浴的情况下遇二苯胺会被染成蓝色

【合作探究】

基因工程的工具酶

EcoRI限制酶和I限制酶的作用示意图。请据图回答:

切点

5L

GXG-AATTC

IIII±TTAAG

3-CTAG

中轴线切点黏性末端

图1

5iCCC手GG3'G

IIIIII

GGGCCCII

3'-:c5'

中轴线(切点)平末端

图2

(1)请说出EcoRI限制酶和SmaI限制酶识别的碱基序列及切割的位点。

提示：EcoRI限制酶识别的碱基序列是一GAATTC—，切割位点在G和A之间；SmaI

限制酶识别的碱基序列是一CCCGGG—，切割位点在C和G之间。

(2)£coRI限制酶和SmaI限制酶作用的结果分别是什么？

提示：EcoRI限制酶切割DNA分子，产生黏性末端，SmaI限制酶切割DNA分子，产

生平末端。

(3)以上实例说明限制酶有何特性？该特性的含义是什么？

提示：说明限制酶具有专一性。专一性指的是限制酶能识别特定的核甘酸序列，并在特

定的切割位点上进行切割。

2.DNA连接酶、限制酶和DNA聚合酶都作用于哪种化学键，分别对化学键有何影响？

提示：均作用于磷酸二酯键，DNA连接酶和DNA聚合酶是形成磷酸二酯键，限制酶是

破坏磷酸二酯键。

基因工程中的载体

分析质粒载体结构模式图，回答下列问题:

拟核吧大肠杆菌细胞

目的基因

插入位点

'氨节青霉素

抗性基因

国制原点」

质粒

大肠杆菌及质粒结构模式图

(1)质粒上氨半青霉素抗性基因的作用是什么？

提示：作为标记基因，便于重组DNA分子的筛选。

(2)为使外源基因插入质粒中，质粒需具备的条件是什么？

提示：有一个至多个限制性内切核酸酶的切割位点。

三.DNA的粗提取与鉴定

1.鸟类和哺乳动物的红细胞都适合用来提取DNA吗？请说明理由。

提示：哺乳动物的成熟红细胞没有细胞核，不适合作为提取DNA的材料。

2.实验过程要充分地搅拌和研磨，如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？

提示：研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，导致看不到

丝状沉淀物，用二苯胺鉴定时颜色反应不明显。

3.实验过程中应如何使用玻璃棒搅拌？为什么？

提示：搅拌时玻璃棒不能直插烧杯底部，搅拌要轻缓，并向一个方向搅拌以便获得较完

整的DNA分子。

【深化拓展】

基因工程的工具酶

1.限制酶

(1)限制酶的作用

限制酶具有特殊的识别和切割功能，在基因工程中，一方面被用于切割含目的基因的

DNA分子，以获取目的基因；另一方面用于切割载体。

(2)识别序列的特点

呈现碱基互补对称，无论是奇数个碱基，还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线，

中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。

CCClGGGRRAGFIA

如GGGICCC以中心线为轴，两侧碱基互补对称；以;为轴，两侧碱基互补对

GGTCCT

(3)限制酶切割方式

①上下交错切割：限制酶在DNA双链的不同位置切割DNA(即在识别序列的中轴线两侧

切割)，产生的DNA片段的末端两条链一长一短，不是平齐的，即黏性末端，如图：

片段分离

黏性末端

②上下对称切害！1：限制能在DNA双链的相同位置切割DNA(即沿着识别序列的中轴线切

割)，这样产生的末端两条链平齐，即平末端，如图：

片段分离

三翻’+福F

平末端

2.DNA连接酶

(1)作用

将具有相同或互补黏性末端以及具有平末端的DNA片段“缝合”成新的DNA分子。

(2)连接方式

DNA连接酶可把黏性末端和平末端之间的缝隙“缝合”起来，相当于把梯子两边的扶手

的断口连接起来，形成两个磷酸二酯键。DNA连接酶与碱基之间氢键的形成无关。

IATTClI--

I'-I■-J-4•-卜।I

CTTAA：G

3.DNA连接酶与DNA聚合酶的比较

项目DNA连接酶DNA聚合酶

相同点催化两个脱氧核甘酸之间形成磷酸二酯键

模板不需要模板需要DNA的一条链为模板

不

作用对象游离的DNA片段单个的脱氧核甘酸

同

作用结果形成完整的DNA分子形成DNA的一条链

点

用途基因工程DNA复制

(1)切割不同的DNA片段但产生相同的黏性末端的一类限制性内切核酸酶称为同尾酶。

这类酶的特点：①识别的序列不同，但可以切割产生相同的黏性末端，且切割产生的黏性末

端可以相互配对；②两个同尾酶切割的DNA片段连接后，一般情况下，不能再被原来的限

制酶识别。如氏/mHI和8g/II就是常见的同尾酶。

限制酶识别序列和切割位点产物

1

5'-GGATCC-3'GATCC-

BamU1

3'-CCTAGG—5'-CCTAGG-

f

1

5,-AGATCT-3,-AGATCT-

Bg/n11

3'-TCTAGA-5'-TCTAGA-

f

(2)限制酶识别的碱基序列的中轴线两侧的碱基互补对称，如BawHl的识别序列

-GGAiTCC-

-CCTJAGG-,中轴线(虚线)两侧的碱基互补对称。

(1)对于链状DNA分子而言，如果用限制酶切割后形成2个DNA片段，则其上有1个限

制酶切割位点；如果用限制酶完全切割后形成3个DNA片段，则其上有2个限制酶切割位

点，以此类推。

(2)对于环状DNA分子而言，如果用限制酶切割后形成1条链状DNA分子，则其上有1

个限制酶切割位点；如果用限制酶完全切割后形成2个DNA片段，则其上有2个限制酶切

割位点，以此类推。

基因工程的载体

1.载体上标记基因的标记原理

载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗

相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内

表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可

以只保留转入载体的受体细胞，原理如图所示:

在含有氨芳青霉素

的培养基上培养'

只有含有载体

并且载体上的

霉素抗性基有的大肠杆菌中

标记基因表达

因的质粒有载体进入，有的

没有载体进入的大肠杆菌才

能存活并增殖

2.作为载体所具备的条件

条件分析

稳定并能复制目的基因稳定存在且数量可扩大

有一个至多个限制酶

可携带多个或多种外源基因

切割位点

具有特殊的标记基因便于重组DNA的鉴定和选择

无毒害作用避免受体细胞受到损伤

3.基因工程中的载体与细胞膜上的载体蛋白的区别

基因工程中的载体细胞膜上的载体蛋白

本质细菌的质粒、噬菌体、动植物病毒等细胞膜上的蛋白质

携带外源基因进入受体细胞中，并在受体细胞中

运载要进出细胞的特

作用进行自我复制，或整合到染色体DNA上，随染

定物质

色体DNA进行同步复制

（1）基因工程中常用的载体有质粒、动植物病毒、噬菌体等。

（2）质粒与载体的关系：一方面，质粒是基因工程中常用的载体，但载体并不都是质粒；

另一方面，天然质粒并不完全符合作为载体的条件（如没有合适的标记基因等），往往需要人

工改造。

三.DNA的粗提取与鉴定

1.粗提取DNA的方法步骤

、4七冰

等

体

身箱静置机

|静置2~3min,

尸几分钟体

积

30g10mL纱布,分用玻璃棒卷

洋葱研磨液w~为％起丝状物，并

冷95

酒

（含核精用滤纸吸去

物质）水分

配取上清液

器

一.

塑

离心考1500r/min[料10000r/min离心

次离心5min离5min,弃上清液,

管心将沉淀物（粗提

管取的DNA）晾干

|研磨洋葱|------取上清液||析出DNA|

2.DNA粗提取的注意事项

(1)加入研磨液后，必须充分研磨，否则细胞核不会充分破碎，释放出的DNA量就会减

少。

(2)粗提取的DNA中可能含有少量的蛋白质等。

(3)析出DNA时必须用“冷酒精”。预冷的酒精具有以下优点：

①可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解。

②抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出。

③低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂。

(4)实验中出现的丝状物的主要成分是DNA,实际上每一根“丝”都是由许多DNA分子

聚集在一起形成的，应用玻璃棒沿一个方向缓慢搅拌，避免破坏DNA。

(5)为减少DNA的损失，实验过程中一般使用纱布过滤。

3.归纳法分析各步骤的原理或目的

步骤原理或目的

充分研磨使细胞破碎，DNA溶解于研磨液中

除去细胞膜等不溶杂质，得到与蛋白质等杂质结合在一起的溶解于滤液

过滤(或离心)

(或上清液)的DNA

搅拌(或离心)析出加入预冷的酒精溶液，蛋白质溶于酒精，DNA不溶于酒精，将DNA和

DNA蛋白质等杂质分离

溶解用2mol/L的NaCl溶液溶解DNA

鉴定DNA二苯胺试剂现配现用，水浴加热，溶液变蓝色则证明有DNA存在

第47讲基因工程的基本操作程序

［学习目标］

1.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的

基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测与鉴定等步骤。

2.利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR

实验。

【模型建构】

“筛选合适的目福回

目的基因的

PCR技术扩增目的基因卜

组成:启动子、目的基因、

基因表达载终止子、标记基因等

NA段

DN片

体的构建

扩

构建：限制酶切割、DNA的

基因工

及

连接酶连接增

程的基

泳

本操作植物细胞:花粉管通道电

定

鉴

程序将目的基法、农杆菌转化法等

一因导入受一动物细胞：显微注射法|

体细胞

原核生物细胞：Ca2+处理法等

分子水平的检测卜——:

目的基因的

检测与鉴定个体生物学水平的鉴定|

【自主学习】

-目的基因的筛选与获取

1.目的基因

(1)在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就

是目的基因。

(2)主要是指编码蛋白质的基因。

2.筛选合适的目的基因

(1)从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。

(2)随着测序技术的发展，以及序列数据库、序列比对工具等的应用，越来越多的基因的

结构和功能为人们所知，这也为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。

3-利用PCR获取和扩增目的基因

(l)PCR是聚合酶链式反应的缩写。

(2)原理：DNA半保留复制o

(3)DNA复制所需的基本条件

参与的组分在DNA复制中的作用

解旋酶(体外用高温代替)打开DNA双链

DNA母链提供DNA复制的模板

4种脱氧核甘酸合成DNA子链的原料

DNA聚合酶催化合成DNA子链

引物使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核昔酸

(4)PCR反应条件：一定的缓冲溶液、DNA模板、分别与两条模板链结合的引物、4

种脱氧核甘酸和耐高温的DNA聚合酶；同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。

(5)扩增的过程

基于PCR的过程，回答下列问题：

3一“3,

,UUUUUUUUUUUMI1J

3，,nnnnnnnnnnnrmr[5,

待扩增的DNA片段

LIUUULIUIJL1UULI哪

A.nnnnnnnnnnnn

过程1为变性,该阶段的温度为90一。C以上,目的是使双链DNA解聚为单链。

过程11为复性，该阶段的温度为皎工左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA

结合。

过程III为延伸,该阶段的温度为22工左右，该过程需要在Q］耐高温的DNA聚合酶的

作用下，利用4种脱氧核甘酸为原料，根据碱基互补配对原则从子链的3二端延伸合成新的

子链DNA。

(6)PCR产物的鉴定：常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定。

二基因表达载体的构建

1.目的

(1)使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。

(2)使目的基因能够表达和发挥作用。

2.组成

终止子

(终止转录)

标记基因

(鉴别和筛选

目的基因)

(1)启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，是RNA聚合酶识别和

结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA。

(2)终止子也是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的工相当于一盏红色信

号灯，使转录在所需要的地方停下来。

3.基因表达载体的构建过程

(1)用一定的限制酸切割载体，使它出现一个切口。

(2)用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。

(3)利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处,这样就形成了一个重组DNA

分子。

三将目的基因导入受体细胞

1.我国科学家独创的方法：花粉管通道法。

2.花粉管通道法的操作方式有多种，例如：

(1)用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中。

(2)在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将夜滴加在花柱切面上，使目的基

因借助花粉管通道进入胚囊。

3.将目的基因导入植物细胞常用的方法还有五枉菌转化法。

四目的基因的检测与鉴定

1.首先是分子水平的检测

检测目的检测方法

受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因

PCR等技术

目的基因是否转录出了mRNA

目的基因是否翻译成相应蛋白质抗原一抗体杂交

2.其次，还需要讲行个体牛.物学水平的鉴定。

3.目的基因还可以通过构建基因文库来获取。

4.将目的基因导入动物受精卵最常用的方法是显微注射法。

5.将目的基因导入大肠杆菌时，研究人员一般先用胃处理大肠杆菌细胞，使细胞处

于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因我达载体导入其中。

【合作探究】

目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建

类型体内DNA复制PCR

细胞有丝分裂前的______和减

时期人工控制，随时进行

数分裂前的________

场所细胞内细胞外

是否需要ATP需要不需要

在_______作用下，细胞提供能90℃以上________,DNA双链

解旋

量，________双链解开________，不需要解旋酶

解旋酶、DNA聚合酶、DNA连

酶—

接酶等

一条链不连续合成，再由DNA分别从两条引物的__________________,

合成子链

连接酶连接都是连续合成

3，

3，||||-----5'

5,山T5，

过程S，_“II

3，

__________________（有冈崎片段）

循环次数受生物体自身控制一般要经历30次

产物完整DNA两种引物之间的_________

①都需要提供DNA模板；②都需要在一定环境中进行；③DNA合成方

相同点

向都是从子链的5'端向3'端延伸

提示：间期间期解旋酶部分DNA高温解聚全部解开耐高温的DNA聚合酶

3'端开始延伸边解旋，边复制变性、复性、延伸DNA片段

2.启动子和起始密码子有什么区别？终止子和终止密码子有什么区别？

提示：启动子和终止子都是一段有特殊结构的DNA序列，分别位于基因的首端和尾端，

分别负责调控基因转录的开始和结束。而起始密码子和终止密码子都是mRNA上的三个相连

的碱基序列，分别决定翻译的起始和终止。

二.将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定

1.为什么在用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中，一定要将目的基因插入Ti质

粒的T-DNA上？

提示：Ti质粒上的T-DNA也称为可转移DNA,可转移至受体细胞，并且整合到受体细

胞的染色体DNA上。

2.如图为抗虫棉的接种实验，结合图示（左图为抗虫转基因棉使虫体发育不正常）探究以

下问题：

抗虫棉的接种实验（左为抗虫转基因棉）

（1）判断抗虫棉的接种实验属于鉴定。

（2）检测方法是,观察指标是.

提示：（1）个体生物学水平（2）让害虫吞食棉叶害虫的存活情况

【深化拓展】

目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建

1.PCR技术

(l)PCR中的环节

环节温度控制目的

预变性90℃以上增加大分子模板DNA彻底变性的概率

变性90〜95℃使双链DNA解聚为单链

I55-60℃两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合

循

复性

环在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成

170〜75℃

新的DNA链

延伸

(2)PCR反应过程图解

①第一次循环示意图

IliumIIIII^

变性七3,

3T~I~।~n~।~।~।।।।।55।।।—p-]~~।~~।।।।।।

复性|55X,

3,.......................s/辘S，

IIIIIII........5..,,||||||^

引物I

,延伸172t引物口，

5-1IIIIIIIIIlliy1111111111113(

引物I'J

②PCR扩增的结果示意图(如图)

引物n

3'-5'

口

I11IIIIIIy

引物I

③PCR扩增的计算：理论上DNA呈指数扩增。

a.若开始只有一个DNA提供模板，则循环〃次后获得的子代DNA数目为2"个。

b.若开始有No个DNA提供模板，则循环“次后获得的子代DNA数目为M2"个。

(l)PCR反应过程的两点提醒

①复性不一定均为引物与DNA模板结合。复性时，引物与DNA模板的结合是随机的，

也存在DNA解开的两条链的结合。

②PCR反应的结果不都是所需的DNA片段。因为第一次循环得到的DNA片段只有一种

引物，比所需的DNA片段要长，从第二次循环才出现所需的DNA片段，这样的片段存在两

种引物。

(2)PCR中与引物有关的5个易错点

①设计引物的依据通常是目的基因两端的核昔酸序列。

②用于PCR的引物长度通常为20〜30个核甘酸。若引物长度过短，则引物与模板链结

合的特异性较差。

③两种引物需符合以下要求，否则引物失效，得不到扩增产物:

a.每种引物内部不能发生局部碱基互补配对，否则会导致自身折叠；

b.两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对，否则会导致引物自连。

④为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的5'端加上限制酶的酶切位

点，且常在两种引物上设计加入不同的酶切位点，主要目的是保证目的基因与载体的正向连

接。

⑤复性温度与设计的引物(长度、碱基组成)有关：

a.长度相同但G—C含量高的引物需要设定的复性温度较高；

b.若复性温度过高，则会破坏引物与模板的结合，可能导致PCR反应得不到任何扩增

产物。

方法技巧

解答利用PCR获取和扩增目的基因类试题的两个关键点

解答利用PCR获取和扩增目的基因类试题时首先要明确PCR所需的条件、过程，其次

要掌握PCR与体内DNA复制的异同。

(1)关键点一：图解法巧记PCR过程中的温度变化

①高温②低温③适温

重复①〜③步

变性复性延伸

►25-30次

温-目的DNA片段

度扩增100万倍以上

(七)子链延伸、

vz\____/DNA加倍

含食DNA单链

I案与引物结合

-DNA双螺旋

时间(min)

(2)关键点二：PCR与体内DNA复制在场所、解旋方式、酶的种类、温度调节、产物等

方面均存在不同，需要牢固掌握才能准确答题。

2.基因表达载体构建时有关限制酶的选择

选择限制酶时要考虑目的基因两端的限制酶切割位点、质粒上的限制酶切割位点及是否

破坏目的基因和标记基因来确定限制酶的种类。

PstISmaIPstI

口标记基因

乙

(1)根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类

①应选择酶切位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择Ps/I。

②不能选择酶切位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择Snal。

③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因

和质粒，如图甲也可选择用PstI和EcoRI两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的酶切

位点)。

(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类

①所选限制酶与切割目的基因的限制酶一般相同，以确保具有相同的黏性末端。

②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制前应不能切割质粒上的所有标

记基因，即至少要保留一个标记基因，用于重组DNA的鉴定和选择。如图乙中质粒不能使

用限制酶SnaI切割，因为会破坏标记基因.

基因表达载体易错点剖析

(1)基因工程中的基因表达载体¥载体：基因表达载体与载体相比增加了目的基因。

(2)目的基因插入位点不是随意的：基因表达载体需要启动子与终止子的调控，所以目的

基因应插入启动子和终止子之间的部位，若目的基因插入启动子部位，启动子将失去原功能。

将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定

1.将目的基因导入植物细胞

方法实例操作方式

①可以用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房

花粉管将基因导入

中；②可以在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶

通道法棉花细胞

液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊

将拟南芥花序①可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然

农杆菌浸没在含有农后筛选转化细胞，并再生成植株；②可以将花序直接浸没在含

转化法杆菌的溶液中有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进

进行转化行筛选、鉴定等

!：易错警示--

(D转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。

(2)此处的“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。

2.将目的基因导入其他受体细胞的方法

受体细胞类型常用方法过程

将含有目的基因的表达载体提纯一取受精

卵一显微注射一注射了目的基因的受精

动物细胞显微注射法

卵，经胚胎早期培养一胚胎移植一获得具

有新性状的动物

原核生物细胞先用Ca2+处理大肠杆菌细胞(增加细胞壁

Ca2+处理法

(大肠杆菌应用通透性)~细胞处于一种能吸收周围环境

最广泛）中DNA分子的生理状态一将重组的基因

表达载体导入该细胞中

：3方法技巧

农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入

第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上，第二次拼接（非人工操作）是指插

入目的基因的T-DNA被拼接到受体细胞的染色体DNA上；第一次导入是将含目的基因的

Ti质粒导入农杆菌，第二次导入（非人工操作）是指含目的基因的T