综合性设计性试验内容-热激诱导的玉米幼苗耐热性观及其生理

综合性、设计性实验内容

——热激诱导的玉米幼苗耐热性观

及其生理生化机制研究第一部分实验背景MechanicalstimulationBioticstressTouchWindRainWoundMechanicalstimulationBraam2005返回Bioticstress返回Haley1995Yahraus1995Garces2001H2O2Ca2+NOBorsics2001Polisensky1996Braam1992植物细胞中ROS产生途径①⑥⑤④③②Oxalateoxidase⑦APXGRDecomposationCAT氧化还原平衡60~90%10~40%H2O2O2.-OH.1O21mS~min4mS2mS1nS第二部分植物材料的培养、热激和热处理植物材料的培养品种为晴3或鲁玉13的玉米种子（购于西山种子公司）→用0.1%HgCl2消毒10min后→用蒸馏水漂洗干净→用蒸馏水于26℃下吸涨12h→播于垫有6层湿润滤纸的带盖白磁盘（24cm×16cm）中→于26℃下暗萌发60h→计算发芽率

→选取长势一致的玉米幼苗做以下处理（去除较矮或较高的玉米幼苗）。热激把上述玉米幼苗经42℃热激处理4h并于26℃恢复培养4h后。对照组（未热激）玉米幼苗仍在26℃下继续培养8h。

热处理恢复后，然后把经热激和未热激的玉米幼苗转入47℃下高温处理14~17h（白磁盘加盖）。伤害率和存活率测定处理结束后，先观察伤害率（胚芽鞘明显变褐），在把玉米幼苗转到26℃下恢复培养7d，每天光照12h，然后计算存活率（以恢复培养过程中能够转绿并恢复生长的玉米幼苗视为存活的幼苗）。第三部分生理指标的测定一、热激诱导的玉米幼苗耐热性部分

生理指标的测定伤害率存活率组织还原力（ＴＴＣ还原力）膜伤害----丙二醛（ＭＤＡ）含量直接观察统计HeatSaltDroughtHeavymetal532nm440nm返回１、伤害率的测定返回２、存活率的测定返回植物组织活力测定方法参考文献３、组织活力的测定原理

有活力的植物组织由于呼吸作用的存在，底物脱下来的Ｈ＋可以形成NADH2或NADPH2,无色的TTC（红四氮唑）可以被前者还原为红色的TTF（三苯基甲潜），其最大光吸收为485nm。测定：分别取48℃高温处理17h

实验组和对照组的胚芽鞘0.２g

→加入5ml0.6%TTC溶液（用50mmol/LPBS,pH7.0配制）→抽气使TTC渗入组织→27℃,15h→去除TTC溶液→着色的胚芽鞘加入少许石英砂和95%乙醇→充分研磨提取TTF→80℃水浴10min→冷却后定容到25ml→测定OD485

→用OD485.g-1FW表示组织活力。返回MDA含量测定方法参考文献４、MDA含量的测定原理

植物在遇到干旱、高温、低温、盐渍以及衰老等情况下，植物体内H2O2、O2.-、OH.等活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)大量积累（返回），导致膜脂过氧化而积累MDA,因此MDA常作为植物逆境伤害指标。

在酸性条件下MDA与硫代巴比妥酸（TBA）反应生成粉红色化合物，此化合物在532nm处有最高吸收峰，ε=155mM-1.cm-1。MDA提取：分别取0.5g实验组和对照组的胚芽鞘→加入3mL5%三氯乙酸（TCA）和少许石英砂→充分研磨→用2mL5%TCA洗研钵→5000rpm离心10min→上清液定容至10mL。测定：分别取上清液各2mL→加入0.6%TBA（用20%TCA配制）2mL→煮沸15min→冷却后分别测定OD600和OD532。ASA测定。计算：MDAcontent=

(mmol.g-1FW)返回二、热激诱导的玉米幼苗耐热性的可能机制抗氧化酶系统，包括过氧化氢酶（CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）、过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）等。抗坏血酸含量的测定脯氨酸（Pro）含量的测定蛋白质含量的测定抗氧化系统测定实验背景CAT、APX、POD、PPO是植物体中非常重要的末端氧化酶，CAT、APX、

POD可以清除植物体内多余H2O2，PPO可以把酚类物质转变为醌，后者对病原微生物起重要的抑制和杀伤作用。因此，它们在植物抗病性、抗热性等抗逆性中起着非常重要的作用，是植物抗逆性的重要生理指标。高O2亲和力，占耗氧量80%PPO，抗病及伤，对O2亲和力弱APX，抗逆性乙醇酸氧化酶黄素氧化酶，对温度不敏感对O2亲和力极低CAT，抗逆性POD，抗逆性SOD，抗逆性NADH/NADPHFMNUQcytbcytc1cytaa3O2交替氧化酶，抗CN-抗氧化酶与植物抗逆性关系抗氧化酶动力学曲线植物抗氧化酶提取和测定参考文献返回１、四种抗氧化酶的提取分别取0.5g实验组和对照组的胚芽鞘→加入少许石英砂和3ml提取液（50mmol/LPBS,pH7.0,内含0.１mmol/LEDTA,0.2mmol/LASA,1%PVP）→充分研磨→转入离心管中→用2ml提取液洗研钵→10000rpm离心10min→上清液定容至5ml→测定四种酶活性或分装后转至-20或-80℃保存。

2、CAT和APX活性的测定原理

H2O2和ASA分别在240和290nm处有最高吸收峰，它们的毫摩尔吸收系数ε分别为0.0４和2.8mM-1cm-1。因此，可以用单位时间内H2O2或ASA的消耗量分别表示CAT或APX活性。CAT活性测定：反应混合液（50mmol/LPBS,pH7.0,内含１０mmol/LH2O2

）2.9ml→加入50ml酶液→25℃预热５min→加入600mmol/LH2O250ml启动反应→分别读出反应0.5min和3.5min的OD值→求出ΔOD240。APX活性测定：反应混合液（50mmol/LPBS,pH7.0,内含1mmol/LASA

）2.9ml→加入50ml酶液→25℃预热５min→加入60mmol/LH2O250ml→分别读出反应10Sec和60Sec的OD值→求出ΔOD290。CAT或APXactivities=

(mmol.g-1FW)3、POD和PPO活性的测定原理

1、愈创木酚（4-邻甲氧基苯酚）+H2O2

——四邻甲氧基苯酚（Amax=470nm，ε=26.6mM）

2、邻苯二酚———邻醌（Amax=410nm）POD测定：取POD反应混合液（10

mmol/L愈创木酚，5mmol/LH2O2,用PBS溶解）2.95ml，加入酶液50ml（空白调零用PBS取代），立即记时，摇匀，反应3min，测出A470。PPO测定：取PPO反应混合液（20mmol/L邻苯二酚，用PBS溶解）2.8ml，加入酶液0.2ml（空白调零用PBS取代），立即记时，摇匀，反应2min，测出A410。以每分钟A值变化0.01所需要的酶液的量为一个活力单位（U），则：PODactivities=

(mmol.g-1FW)PPOactivities=

(U.g-1FW)４、抗坏血酸含量的测定原理：还原型抗坏血酸（ASA）可把Fe3+还原为Fe2+，后者与红菲罗啉反应形成红色螯合物，最大光吸收为534nm．抗坏血酸的提取：同MDA提取．ASA测定：1ml样品→加入1ml5%TCA→1ml无水乙醇→摇匀→0.5ml0.4%H3PO4－乙醇→1ml0.5%红菲罗啉（BP）－乙醇→0.5ml0.03%FeCl3－乙醇→30℃水浴30min→OD534DASA测定：1ml样品→加入0.5ml60mmol/LDTT－乙醇→0.5ml

Na2HPO4－NaOH混合液使溶液的调至7～8→室温10min→0.5ml20%TCA把调到1~2→按上述方法测定．标准曲线的制作：以5%TCA为溶剂配制2，4，6，8，10mg/mlASA按上述方法制作标准曲线或根据K=0.187(mmol/L)-1cm-1计算．脯氨酸测定实验背景植物在遇到干旱、高温、低温、盐渍等逆境胁迫情况下，植物体内通过①蛋白质的降解、②从头合成和③降低脯氨酸氧化酶活性等途径合成脯氨酸（Proline,Pro）,Pro具有保护蛋白质（酶）、降低植物细胞水势、清除ROS等复杂的生理功能，从而提高了植物对逆境的抵抗能力。Pro具有保护蛋白质（酶）、降低植物细胞水势清除ROSPro提取与测定方法参考文献５、Pro含量的测定原理

植物在遇到干旱、高温、低温、盐渍等逆境胁迫情况下，植物体内通过①蛋白质的降解、②从头合成和③降低脯氨酸氧化酶活性等途径合成脯氨酸（Proline,Pro）,从而提高了植物对逆境的抵抗能力。在酸性条件下与茚三酮发生反应生成红色化合物，此化合物在520nm处有最高吸收峰，ε=3.24mM-1.cm-1

。Pro的提取：分别取0.5g实验组和对照组的胚芽鞘→加入3mL3%磺基水杨酸（SSA）和少许石英砂→充分研磨→用2mL3%SSA洗研钵→10000rpm离心10min→上清液定容至5mL。测定：上清液各2mL→分别加入2mL冰乙酸和2mL茚三酮试剂→煮沸15min→冷却后分别测定A520计算：Procontent=

(mmol.g-1FW)595nm465nmG250G250蛋白质复合物返回６、蛋白质含量的测定原理：考马斯亮蓝的最大光吸收为465nm，它与蛋白质结合后最大吸收峰转移至595nm，并且反应迅速（2min），稳定性好（1h）。蛋白质的提取：同抗氧化酶的提取。测定方法——考马斯亮