《酶工程制药技术》课件-固定化酶

EnzymeEngineering

酶工程第六章固定化酶第一节概述第二节固定化酶的性质及其影响因素第三节固定化酶的制备第四节固定化细胞第五节固定化辅酶和原生质体第六节酶反应器和固定化酶（细胞）的应用（1）酶的稳定性较差

（2）酶的一次性使用

（3）产物的分离纯化较困难酶催化的缺陷为什么要将酶固定化?4——如果能设计一种方法，将酶束缚于特殊

的相，使它与整体相（或整体流体）分

隔开，但仍能进行底物和效应物（激活

剂或抑制剂）的分子交换。

——这种固定化的酶既具有酶的催化特性，

又具有一般化学催化剂能回收、反复使

用等优点，并且生产工艺可以连续化、

自动化。设想5进展1916年Nelson和Griffin利用活性炭吸附蔗糖酶固定化酶的研究从20世纪50年代开始1953年德国的Grubhofer和Schleith采用聚氨基苯乙烯树脂为载体，经重氮法活化后，分别与羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合，而制成固定化酶。20世纪从60年代起，固定化酶的研究迅速发展1969年，日本的千畑一郎首次在工业生产规模应用固定化氨基酰化酶从DL-氨基酸生产L-氨基酸，实现了酶应用史上的一大变革。6

所谓固定化酶，是指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复使用。固定化酶的定义7“水不溶酶”（waterinsolubleenzyme）

“固相酶”（solidphaseenzyme）8在1971年第一届国际酶工程会议上，正式建议采用“固定化酶”（immobilizedenzyme）的名称。

固定化酶正式定名9（l）极易将固定化酶与底物、产物分开；

（2）可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱

连续反应；

（3）在大多数情况下，能够提高酶的稳定性；

（4）酶反应过程能够加以严格控制；

（5）产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺；

（6）较游离酶更适合于多酶反应；

（7）可以增加产物的收率，提高产物的质量；

（8）酶的使用效率提高，成本降低。固定化酶与游离酶相比，具有下列优点:10缺点：（l）固定化时，酶活力有损失；（2）增加了生产的成本，工厂初始投资大；（3）只能用于可溶性底物，而且较适用于小分子

底物，对大分子不适宜；（4）与完整菌体相比不适宜于多酶反应；（5）胞内酶必须经过酶的分离程序。第二节固定化酶的性质及其影响因素一．影响固定化酶性质的因素二．固定化后酶性质的变化三．评价固定化酶的指标一．影响固定化酶性质的因素1．酶本身的变化，主要是由于活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生了变化。一．影响固定化酶性质的因素2．载体的影响（1）分配效应（2）空间障碍效应（3）扩散限制效应3.固定化方法的影响二．固定化后酶性质的变化1．固定化对酶活性的影响：酶活性下降，反应速度下降二．固定化酶的性质2．固定化对酶稳定性的影响（1）操作稳定性提高（2）贮存稳定性比游离酶大多数提高。

(3)对热稳定性，大多数升高，有些反而降低。

(4)对分解酶的稳定性提高。（5）对变性剂的耐受力升高2．固定化后酶稳定性提高的原因：a.固定化后酶分子与载体多点连接。b.酶活力的释放是缓慢的。c.抑制自降解，提高了酶稳定性。3．pH的变化PH对酶活性的影响：（1）改变酶的空间构象（2）影响酶的催化基团的解离（3）影响酶的结合基团的解离（4）改变底物的解离状态，酶与底物不能结合或结合后不能生成产物。固定化酶pH的变化1）载体带负电荷，最适pH比游离酶的最适pH高（向碱性方向移动）。

2）载体带正电荷，最适pH比游离酶的最适pH低（向酸性方向移动）。3）载体不带电荷，最适Ph一般不改变（有时也会有所改变，但不是由于载体的带电性质所引起的。）载体的性质对固定化酶作用的最适pH有明显的影响。3．固定化酶pH的变化（2）产物性质对pH的影响催化反应的产物为酸性时，固定化酶的最适pH值比游离酶的pH值高；催化反应的产物为碱性时，固定化酶的最适pH值比游离酶的pH值低；催化反应的产物为中性时，固定化酶的最适pH值一般不变；这是由于固定化载体成为扩散障碍，使反应产物向外扩散受到一定的限制所造成的。当反应产物为酸性时，由于扩散受到限制而积累在固定化酶所处的催化区域内，使此区域内的pH比降低，必须提高周围反应液的pH，才能达到酶所要求的pH。为此，固定化酶的最适pH比游离酶要高一些。反之，反应产物为碱性时，由于它的积累使固定化酶催化区域的pH升高，故此使固定化酶的最适pH比游离酶的最适pH要低一些。一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化Eg：用重氮法制备的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，其作用的最适温度比游离酶高5—10以共价结合法固定化的色氨酸酶，其最适温度比游离酶高5—15同一种酶，用不同的方法或不同的载体进行固定化后，其最适温度也有可能提高。Eg：氨基酰化酶，用DEAE-葡聚糖凝胶经离子键结合法固定化后，其最适温度（72）比游离酶的最适温度（60）提高12度；用DEAE-纤维素固定化的，其最适温度（67）比游离酶提高7度；而用烷基化法固定化的氨基酰化酶，其最适温度却比游离酶有所降低。固定化酶作用的最适温度可能会受到固定方法和固定化载体的影响。固定化酶最适温度的变化℃℃5．底物特异性变化固定化酶的底物特异性与游离酶比较可能有些不同，其变化与底物相对分子质量的大小有一定关系。作用于小分子底物的酶特异性没有明显变化既可作用于小分子底物又可作用于大分子底物的酶特异性往往会变化。Eg：胰蛋白酶：高分子蛋白、低分子（二肽、多肽），固定在羧甲基纤维素上，对二肽或多肽的作用保持不变，而对酪蛋白的作用仅为游离酶的3%；以羧甲基纤维素为载体经叠氮法制备的核糖核酸酶，当以核糖核酸为底物时，催化速率仅为游离酶的2%，而以环化鸟苷酸为底物时，催化速率可达游离酶的50—60%。三．评价固定化酶的指标：1．酶活定义（IU)：在特定条件下，每一分钟催化一个微摩尔底物转化为产物的酶量定义为1个酶活单位。

——计量单位2.酶比活定义（游离）：每毫克酶蛋白或酶RNA（DNA)所具有的酶活力单位

——品质的体现三．评价固定化酶的指标：1.固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有的酶活力单位。或：单位面积（cm2）的酶活力单位表示（酶膜、酶管、酶板）。2.操作半衰期：衡量稳定性的指标。连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一半所需要的时间（t1/2）三．评价固定化酶的指标：3.4.或称偶联效率，活力保留百分数。5.相对酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的固定化酶活力与游离酶活力的比值称为相对酶活力

四固定化酶的活力测定方法介绍1.振荡测定法：称取一定量的固定化酶加入一定量的底物溶液，一边振荡或搅拌，一边进行催化反应取出一定量的反应液进行酶活力测定。2.酶柱测定法：将一定量的固定化酶装进具有恒温装置的反应柱中让底物溶液以一定的流速流过酶柱收集流出的反应液测定其中产物的生成量或底物的消耗量

四固定化酶的活力测定方法介绍3.连续测定法利用连续分光光度法等测定方法可以对固定化酶反应液进行连续测定，从而测定固定化酶的酶活力。

28——酶的固定化方法很多，但对任何酶都适用的方法是没有的。固定化酶的制备方法29

制备固定化酶要根据不同情况（不同酶、不同应用目的和应用环境）来选择不同的方法，但是无论如何选择，确定什么样的方法，都要遵循几个基本原则。

一种固定化酶制备人参抗癌有效成份的方法（发明专利）

/patentfm/pt89/888258_3A08C.htm

固定化酶的制备原则30——必须注意维持酶的催化活性及

专一性，保持酶原有的专一性、

高效催化能力和在常温常压下

能起催化反应的特点。原则131——固定化应该有利于生产自动化、

连续化。原则232——固定化酶应有最小的空间位阻。原则333——酶与载体必须结合牢固，从而使

固定化酶能回收贮藏，利于反复

使用。原则434——固定化酶应有最大的稳定性，在制

备固定化酶时，所选载体不与废物、

产物或反应液发生化学反应。原则535原则6——固定化酶应易与产物分离。36原则7——固定化酶成本要低，应为廉价的、

有利于推广的产品，以便于工业

使用。37——充分考虑到固定化酶制备过程和

应用中的安全因素。原则8第二节

固定化酶的性质及其影响因素提要影响固定化酶性质的因素固定化酶的性质评价固定化酶的指标酶本身的变化载体的影响固定化对酶活性的影响固定化对酶稳定性的影响最适pH的变化最适温度变化底物特异性与游离酶不同评价指标活力测定方法第三节固定化酶的制备一．一般方法及特点二．酶的固定化方法一．一般方法及特点关键在于选择适当的固定化方法和必要的载体以及稳定性研究、改进。1．四大类方法：吸附法（包括电吸附法）结合法（无机多孔材料）交联法（双功能试剂）包埋法（微胶囊法）各类固定化方法的特点比较:比较项目吸附法结合法交联法包埋法物理吸附.共价键结合离子键结合制备难易易难易较难较难固定化程度弱强中等强强活力回收率较高低高中等高载体再生可能不可能可能不可能不可能费用低高低中等低底物专一性不变可变不变可变不变适用性酶源多较广广泛较广小分子底物、药用酶2．选择方法依据：（1）酶的性质（2）载体的性质（3）制备方法的选择3．固定化后酶的考察项目：（1）测定固定化酶的活力，以确定固定化过程的活力回收率。（2）考察固定化酶稳定性（2）考察固定化酶最适反应条件二．酶的固定化方法（一）吸附法（二）结合法（三）交联法（四）包埋法（entrappingmethod）酶和细胞固定化示意图（一）吸附法1．物理吸附：利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上。

（一）吸附法常用载体：无机载体：氧化铝、活性碳、皂土、硅藻土、金属氧化物、硅胶。一般吸附量<1mg蛋白/克吸附剂有机载体：淀粉、白蛋白等。一般吸附量几十毫克蛋白/克吸附剂研究热点：大孔型合成树脂、陶瓷（二）结合法1离子键结合法2共价键结合法☆1离子键结合法概念：通过离子键使酶与载体结合的固定化方法称为离子键结合法。常用载体是一些不溶于水的离子交换剂：DEAE-纤维素，DEAE-葡聚糖凝胶，TEAE-纤维素等。活力损失较少；但由于通过离子键结合，结合力较弱，酶与载体的结合不牢固，在pH和离子强度等条件改变时，酶容易脱落，所以用离子结合法制备的固定化酶，使用注意：pH、离子强度、温度。DEAE：二乙氨乙基(Dicthylaminoethyl

）TEAE：三乙氨乙基

(Tricthylaminoethyl

）50——操作简单，

——处理条件温和，

——酶的高级结构和活性中心的氨基酸

残基不易被破坏，

——能得到酶活回收率较高的固定化酶。离子结合法的优点51——载体和酶的结合力比较弱，容易受

缓冲液种类或pH的影响，在离子强

度高的条件下进行反应时，酶往往

会从载体上脱落。缺点52迄今已有许多酶用离子结合法固定化，例如1969年最早应用于工业生产的固定化氨基酰化酶就是使用多糖类阴离子交换剂DEAE-葡聚糖凝胶固定化的。53DEAE-Sephadex固定化氨基酰化酶：将DEAE-SephadexA25充分溶胀，用0.5mol/LNaOH和水洗涤后，加入pH7.0—7.5的米曲霉3042粗酶液(水解乙酰—DL-Ala活力为25umol/m1·h)充分混合(1g湿重载体加60ml酶液)后，于低温下搅拌过夜后，吸去上清液，再用蒸馏水和0.15mol/L醋酸钠水溶液洗涤固定化酶，置4℃备用。固定化酶活力回收50-60％，水解乙酰—DL—A1a活力为600-800umol/g·h湿固定化酶。氨基酰化酶也可固定于DEAE—纤维素。54固定化青霉素酰化酶的生产55原理是酶蛋白分子上的功能基团和固相支持物表面上的反应基团之间形成共价键，从而将酶固定在支持物上。

归纳起来有两类:

——一是将载体有关基团活化，然后与酶有关基团发生偶联反应。

——另一种是在载体上接上一个双功能试剂，然后将酶偶联上去。2共价结合法(covalentbinding）56——

或

氨基、

、

或

-羧基、巯基、

羟基、咪唑基、酚基等。

——参与共价结合的氨基酸残基不应是

酶催化活性所必需的，否则往往造

成固定后的酶活性完全丧失。可与载体共价结合的酶的功能团57共价结合法与离子结合法或物理吸附法相比的优点

——酶与载体结合牢固，稳定性好，利于

连续使用，一般不会因底物浓度高或

存在盐类等原因而轻易脱落。58缺陷

——反应条件苛刻，操作复杂；

——会引起酶蛋白高级结构变化，破坏部分

活性中心。59——天然有机载体（如多糖、蛋白质、细胞）

——无机物（玻璃、陶瓷等）

——合成聚合物（聚酯、聚胺、尼龙等）所用载体分三类（4）载体活化的方法A．重氮法B．叠氮法C．烷基化反应法D．硅烷化法E．溴化氰法A．重氮法酶蛋白中的游离氨基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基等参与此反应。

很多酶，尤其是酪氨酸含量较高的木瓜蛋白酶、脲酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酯酶、β-葡萄糖苷酶等能与多种重氮化载体连接，获得活性较高的固定化酶。A．重氮法目前在我们国内用的较多的载体是对氨基苯磺酰乙基（ABSE）纤维素、琼脂糖，葡聚糖凝胶和琼脂等该方法需要载体具有芳香族氨基A．重氮法反应式及原理A．重氮法例5′-磷酸二酯酶的固定化。此酶用来降解核酸，可分离得到四个5′-单核苷酸（本成果荣获国家发明三等奖，中国科学院上海生化研究所袁中一等，我国第一个用于工业生产的固定化酶）B叠氮法B叠氮法例用羧甲基纤维素叠氮衍生物制备固定化胰蛋白酶，步骤如下：⑴酯化：CM-纤维素先洗涤干燥，然后悬于无水甲醇中，在冰浴中通入HCl气体，进行酯化反应；然后洗涤，空气干燥。⑵肼解。把酯化后的CM-纤维素悬于甲醇中，再加入80%水合肼回流反应1小时，过滤，洗涤干燥。B叠氮法⑶叠氮化。肼解后的CM-纤维素（1g）加入150ml2%HCl在冰浴中混合，搅拌滴加9ml3%NaNO2反应20min，过滤用冷蒸馏水洗涤，同时加酶(4)偶联：经叠氮化后的载体加入0.05NpH8.0磷酸缓冲液（内含250-500mg酶），5℃搅拌2-3小时，过滤，用0.001NHCl，水洗涤，即为固定化胰蛋白酶（冻干保存）B叠氮法对含有羧机基的载体，与肼基作用生成含有酰肼基团的载体，再与亚硝酸活化，生成叠氮化合物。最后于酶偶联C．烷基化反应法三氯-均-三嗪三氯-均-三嗪纤维素D．硅烷化法多孔玻璃特点：①机械强度好，表面积大。②耐有机溶剂和微生物破坏。载体可以再生，寿命长等。D．硅烷化法一般常用的载体：多孔玻璃，多孔陶瓷。D．硅烷化法D．硅烷化法D．硅烷化法E．溴化氰法本方法主要用溴化氰（CNBr）活化多糖类物质。如纤维素、葡聚糖、琼脂糖等.76溴化氰法能在非常温和条件下与酶蛋白的氨基发生反应，它已成为近年来普遍使用的固定化方法，尤其是溴化氰活化的琼脂糖已在实验室广泛用于制备固定化酶以及亲和层析的固定化吸附剂。77

要求载体惰性，且有一定的机械强度和稳定性，同时具备在温和条件下与酶结合的功能基团；必须在温和pH、中等离子强度和低温的缓冲溶液中；所选择的偶联反应对酶的其他功能基团副作用尽可能少；尽量减少载体的空间位阻对酶活力的影响。共价结合法中的几个影响因素（三）交联法借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。也可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。（三）交联法的形式交联法有2种形式： 酶直接交联法 酶辅助蛋白交联双重固定法

（1）吸附交联法（2）交联包埋法酶直接交联法在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。固定化依赖酶与试剂的浓度、溶液pH和离子强度、温度和反应时间之间的平衡。酶辅助蛋白交联为避免分子内交联和在交联过程中因化学修饰而引起酶失活，可使用第二个"载体"蛋白质.——形成希夫碱的戊二醛，

——形成肽键的异氰酸酯，

——发生重氮偶合反应的双重氮联苯胺或

N，N’-乙烯双马来亚胺等。

最常用的交联剂是戊二醛。交联剂/doc/70270/149550.html戊二醛在蛋白质化学方面的应用由于戊二醛具有提高生物高分子材料的寿命和强度、消毒、灭菌、防腐以及消除抗原等特性，上世纪随着生物高分子材料的开发，戊二醛的应用研究得到了突破性进展。戊二醛与蛋白质交联的特点是活性高、反应快、结合量大、产物稳定、对沸水、酸、酶的抵抗能力强。用戊二醛制备的许多种生物组织材料具有消除抗原、减小排异反应和优异的血相容等优点，可用于人体脏器的修复。采用0.3%戊二醛溶液为交联剂得到的固定化木瓜蛋白酶具有很高的活性回收率，广泛用于啤酒和饮料澄清、肉类嫩化和复配消化药物等方面，有利于提高这种酶的利用率和降低生产成本。以氨丙基多孔硅球作载体，用戊二醛作交联剂制备的固定化嗜热菌蛋白酶在水相中能较好的合成二肽甜味剂Aspartame前体，最高产率可达95%，并具有良好的重复使用性能。将胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶和辣根过氧化物酶通过戊二醛交联反应，固定在牛血清蛋白上，可制成一种高灵敏度的胆固醇生物传感器用的传感膜。84——制备的固定化酶一般比较牢固，可以长

时间使用。

——固定化的酶活回收率一般较低。

——降低交联剂浓度和缩短反应时间有利于

固定化酶比活的提高。

特点（1）吸附交联法先将酶吸附在硅胶、皂土、氧化铝、球状酚醛树脂或其他大孔型离子交换树脂上，再用戊二醛等双功能试剂交联。用此法所得固定化酶也可称为壳状固定化酶。（2）交联包埋法把酶液和双功能试剂（戊二醛）凝结成颗粒很细的集合体，然后用高分子或多糖一类物质进行包埋成颗粒。这样避免颗粒太细的缺点，同时制得的固定化酶稳定性好。（四）包埋法（entrappingmethod）定义：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋法。（四）包埋法包埋法分为网格型和微囊型1．网格型2．微囊型1．网格型(1)概念将酶或含酶菌体包埋在凝胶细微网格中，制成一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。也称为凝胶包埋法2．微囊型包埋法是将酶包埋在各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。由于固定化形成的酶小球直径一般只有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法。

91——包埋法一般不需要与酶蛋白的氨基酸

残基进行结合反应，很少改变酶的高

级结构，酶活回收率较高。

——但是在包埋时发生化学聚合反应，酶

容易失活，必须巧妙设计反应条件。特点92——仅小分子可以通过高分子凝胶的网格扩

散，且这种扩散阻力会导致固定化酶动

力学行为的改变，降低酶活力。

——包埋法只适合作用于小分子底物和产物

的酶，对于那些作用于大分子底物和产

物的酶是不适合的。固定化酶方法研究热点1热处理法：将含酶细胞在一定温度下加热处理一段时间，使酶固定在菌体内，而制备得到固定化菌体。只适用于那些热稳定性较好的酶的固定化，在加热处理时，要严格控制好加热温度和时间，以免引起酶的变性失活。Eg：将培养好的含葡萄糖异构酶的链霉菌细胞在60—65度的温度下处理15min，葡萄糖异构酶全部固定在菌体内。热处理与交联法或其它固定法联合使用，进行双重固定。94

※就是使酶结晶从而实现固定化的方法。

※对于晶体来说，结晶的蛋白质既是

载体也是催化剂。

※可以提供非常高的酶浓度，这一点

对于活力较低的酶而言更具有优越性。2结晶法(crystallization)95——在不断的重复循环中，酶会有损耗，从而使得固定化酶浓度降低。结晶法的局限性96※通过酶分散于水不溶相中从而实现固定

化的方法。

※对于在水不溶的有机相中进行的反应，最

简单的固定化方法是将干粉悬浮于溶剂

中，

并且可以通过过滤和离心的方法将

酶进行分离和再利用。3分散法(dispersion）第三节提要一般方法及特点酶的固定化方法吸附法结合法交联法包埋法第四节微生物、植物和动物细胞固定化细胞特性比较细胞种类植物细胞微生物细胞动物细胞细胞大小/um20-3001-1010-100倍增时间/h>120.3-6>15营养要求简单简单复杂光照要求大多数要光照不要求不要求对剪切力敏感大多数不敏感敏感主要产物色素、药物、香精、酶等醇、有机酸、氨基酸、抗生素、核苷酸、酶疫苗、激素、抗体、酶固定化细胞概念：固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞称为固定化细胞.该细胞能进行正常的生长、繁殖和新陈代谢，又称固定化活细胞或固定化增殖细胞。固定化细胞的特点优点：1.使用固定化细胞省去了酶的分离过程，显著降低了成本。

2.固定化细胞为多酶系统，不需要辅助因子3.增加了细胞对不利环境的耐逆性，可重复使用。4.增加了酶的稳定性。缺点：1.对底物和产物的要求是可以穿过细胞壁细胞膜。2.会形成大量的副产物，降低了纯度。3.维持固定化细胞持续的催化活性远比酶要复杂，有些细胞在条件不适宜的情况下很容易发生自溶，影响产品的稳定性。细胞固定化方法吸附法包埋法吸附法它主要通过载体与细胞间的静电引力，即细胞表面与载体之间范德华作用力，离子键和氢键作用力，才使细胞固定在载体上的。包埋固定法包理法是在细胞自身并不与凝胶基体发生化学键合的情况下将其包埋在半透性聚合物颗粒（或膜）内的一种固定化方法。包埋法的最大优点是能较好的保持细胞内多酶系统的活力，可象游离细胞那样进行产物的发酵生产。常用载体：琼脂、海藻酸钙、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺常用凝胶包埋法通过改变载体溶液参数包埋细胞改变载体溶液、操作温度、盐浓度、pH值和溶剂等参数时，亦可使其转变为凝胶状态，将细胞包埋其中。研究热点——光交联树脂包埋法例：相对分子量为1000-3000的光交联聚氨酯预聚物等，加入1%左右的光敏剂，加水配成一定浓度，加热至50℃，然后与一定浓度的细胞悬浮液混合均匀，摊成一定厚度的薄层，用紫外照射3min，就可制得固定化细胞的目的微生物菌体：不需多次培养、扩大，从而缩短了发酵生产周期植物细胞动物细胞第四节固定化细胞提要特点方法目的第四节结束点击返回第五节固定化原生质体和辅酶一原生质体固定化的方法制备原生质体——将原生质体重新悬浮在含有渗透压稳定剂的缓冲液中配成原生质体悬浮液——包埋法固定化原生质体。关键：原生质体如何制备？二原生质体的制备将对数生长期的细胞收集——悬浮在含有渗透压稳定剂的高渗缓冲液中——去细胞壁——分离纯化——得到原生质体-活性鉴定四辅酶固定化1原因有机辅因子中具有某些特殊的化学基团，参与酶的催化反应(递氢、递电子或递某些化学基团的作用）有机辅因子在使用过程中要流失，并且不能自行再生有机辅因子价格昂贵——工业上应用全酶的关键是有机辅因子的保留和再生辅酶固定化的方法：2固定化方法与酶相似，一般采用溴化氰法，碳二亚胺法以及重氮偶联法等共价偶联，或将其进行适当的化学修饰后固定在超滤器中。3辅酶固定化必须解决辅酶在多个酶之间传递的障碍。策略：先在辅酶的一定部位进行修饰--引入功能团和间隔臂（形成辅酶衍生物）--再与水溶性高分子结合辅酶再生的形式：辅酶和酶共固定 与酶分子偶联成辅酶-酶复合物第五节固定化原生质体和辅酶的固定化原生质体辅酶固定化方法固定化要点原因方法形式第五节结束点击返回第六节酶反应器和固定化酶（细胞）的应用

酶反应器介绍酶反应器的选择和应用固定化酶和细胞的应用生物催化反应器工程通过反应器型式、操作方式的改变能否使生物催化反应效率最大化？将反应与传质紧密相关

一．酶反应器。

分批搅拌反应器。搅拌罐型连续流搅拌桶反应器。固定床型（填充床反应器）流化床反应器连续搅拌桶-超滤反应器循环反应器膜式反应器鼓泡塔型

分批搅拌反应器反应器结构简单，不需要特殊装置，适与小规模试验

连续流搅拌桶反应器连续搅拌釜式反应器

填充床反应器旋转填充床流化床反应器与连续流搅拌桶式反应器类似，是让适量的颗粒状酶悬浮于反应床中，不用搅拌器，而是底物向上流过固定酶床，因此流速要适当控制。

循环反应器高效内循环生物反应器（HCR）

连续搅拌桶-超滤反应器膜式反应器定义：由膜状或板状固定化酶或固定化微生物组装的反应器均称为膜式反应器。类型：直接接触式酶膜反应器、扩散型膜反应器和多相酶膜反应器。膜式反应器采用聚砜中空纤维膜反应器固定淀粉酶可控制淀粉水解，制备糊精。鼓泡塔型反应器适用对象：反应中涉及气体的吸收或产生时适用。气体进入方式：与底物一起从底部进入，经过气体分散板分散。和循环液从底部以切线方向进入。生物催化反应－分离耦合反应器Diagramoftheenzymaticsynthesisofcefaclorwithinsituproductremoval.(1)Complexationreactor,(2)enzymaticreactionreactor,(3)peristalticpump,(4)sintered-glass(G2),(5)mechanicalstirrer.反应－分离耦合反应器成功实现产物在线分离青霉素酰化酶生物催化合成头孢克罗产物在线分离策略实现头孢克罗半连续制备JournalofMolecularCatalysis,17(2):81-87,2003.

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减压式反应器用于生物催化反应中易挥发产物的在线去除

WeiDongzhi*,Yuying,BiocatalysisandBiotransformation,2003,21(3)135-139.

生物催化合成油酸乙基葡萄糖苷酯减压式反应器用常规反应器用反应器选择酶的形式：溶液酶颗粒状或片状固定化酶膜状和纤维状固定化酶底物的物理性质：溶解性、颗粒物质和胶体物质反应操作要求酶的稳定性应用和可塑性和成本酶反应器的应用控制酶反应器液态流动方式反应器中流动方式的改变会使酶与底物的接触不良，造成反应器生产能力降低。流动方式改变造成反混程度的变化，会发生程度不同的反应或副反应。物料粒子进入反应器后所经历的时间称为粒子的年龄。粒子离开反应器时的年龄称为停留时间。反应器内不同年龄的粒子间的混合称为反混。酶反应器的应用酶反应器对底物恒定转化目的：反应器能平稳的进行工作，有利于实现自控操作方法：控制底物流速国外热点：将固定化酶反应器串联或并联操作。酶反应器的应用保持酶反应器的稳定性：防止酶变性、中毒、自溶或载体磨损。防止酶反应器中微生物污染向底物中加入杀菌、抑菌物质，或有机溶剂底物物料预先除菌在45度以上环境中或酸、碱缓冲液中进行反应酶反应器每次用后消毒二．固定化酶（细胞）的应用1．固定化酶（细胞）在工农业生产上的应用2．固定化酶在医药治疗上的应用3．固定化酶在分析化学中应用4．固定化酶和亲和色谱5．固定化酶与环境保护6．新能源开发中的应用7．固定化酶在基础理论研究中应用1．固定化酶（细胞）在工农业生产上的应用葡萄糖异构酶——世界上生产规模最大的一种固定化酶。用吸附法、结合法、凝胶包埋法等进行固定化。

葡萄糖异构酶葡萄糖果糖果葡糖浆固定化酶在工业生产中的应用聚丙烯酰胺凝胶包埋含有延胡索酸酶的产氨短杆菌菌体，制得固定化延胡索酸酶。工业化生产L-苹果酸利用固定化乳糖酶可以连续生产低乳糖奶固定化酵母细胞等微生物可用于生产各种酒类固定化原生质体的应用研究中：固定后化枯草杆菌原生质体生产碱性磷酸酶，使原来存在于细胞中的碱性磷酸酶，全部分泌到发酵液中，提高产率36%，可连续使用37天。2．固定化酶在医药治疗上的应用例1固定化青霉素酰化酶，只要改变pH值等条件，就既可以催化青霉素或头孢菌素水解生成6-氨基青霉烷酸酸或7-氨基头孢霉烷酸也可以催化6-APA或7-ACA与其他的羧酸衍生物进行反应合成新的具有不同恻链基团的青霉素或头孢霉素青霉素酰化酶催化合成头孢类抗生素

7-ACAasnucleus青霉素酰化酶催化合成头孢类抗生素7-ACCAor7-ADCAasnucleus酶促合成头孢类抗生素--Reversiblereaction--Hydrolysisofsubstrateorproductbybiocatalyst--Difficultyofseparationofproductfromreactants++Esterase

HydrolaseSynthetase固定化酶在医药治疗上的应用例2：制造人工肾利用固定化脲酶透析液和活性炭一起制成的体外循环装置，大大提高了疗效。固定化脲酶由酶与离子交换树脂一起制成微小胶囊尿酶可分解尿素为NH3和CO2，NH3被树脂吸附，CO2可由肺部排出，活性炭用以吸附尿素以外的代谢废物。

3．固定化酶在分析化学中应用酶柱和酶管，可与分光光度计、荧光计或电量计结合，形成酶电极，进行某些物质的自动分析。酶电极酶电极特点：快速、方便、灵敏、精确范围：糖类、抗生素、氨基酸