色谱分析概论

关于色谱分析概论

色谱法是一种重要的分离分析方法，它是根据组分在两相中作用能力不同而达到分离目的。

第2页,共62页，星期六，2024年，5月1.1色谱法发展简史

茨维特的实验茨维特（M.S.Tswett)：俄国植物学家，主要从事植物色素的研究工作

1903年3月21日：华沙自然科学会议生物学会议上宣读论文：“Onanewcategoryofabsorptionphenomenaandtheirapplicationtobiochemicalanalysis”第3页,共62页，星期六，2024年，5月

“一种新型吸附现象及其在生化分析上的应用”。在1906

年发表的文章中，首次提出了色谱的概念。第4页,共62页，星期六，2024年，5月茨维特的实验-分离植物色素第5页,共62页，星期六，2024年，5月ts第6页,共62页，星期六，2024年，5月

在色谱法中，将填入玻璃管或不锈钢管内静止不动的一相（固体或液体）称为固定相

；自上而下运动的一相（一般是气体或液体）称为流动相

；装有固定相的管子（玻璃管或不锈钢管）称为色谱柱

。第7页,共62页，星期六，2024年，5月色谱法是一种分离方法。它的特点是：有两相，一是固定相，一是流动相，两相作相向运动。

将色谱法用于分析中，则称为色谱分析。色谱分析是一种分离、分析法。第8页,共62页，星期六，2024年，5月

1941年：英国人马丁与辛格首次突出液-液色谱法（经典液相色谱发）；1952年：英国人马丁与辛格建立气液色谱法（脂肪酸混合物的分离），发展了气相色谱；1956

VanDeemter提出速率理论；1957年美国Golay首先应用小口径毛细管进行色谱分离；1959年Porath和Flodin空间排阻色谱法（固定相：多孔凝胶)1967

Kirkland等研制高效液相色谱仪；1970以后逐渐发展了高效液相色谱；第9页,共62页，星期六，2024年，5月

1975年H.Small研究组建立了离子色谱法；1979年气相色谱应用的飞跃：弹性石英毛细管色谱柱的商品化；20世纪50年代：毛细管电泳技术的建立和发展。其迅速发展在20世纪80年代毛细管区带电泳的建立，之后发展了胶束电动色谱、毛细管凝胶色谱、毛细管电色谱（主要应用于：蛋白质分离、糖分析、DNA测试、手性分离、单细胞分析）我国色谱研究工作起步于1954年，有中科院大连化物所进行早期的理论和技术研究（卢佩章、张玉奎）第10页,共62页，星期六，2024年，5月色谱分析法的重要贡献诺贝尔化学奖：1948年，瑞典Tiselins，电泳和吸附分析；1952年，英国马丁(Martin)和辛格(Synge)，分配色谱。应用的科学领域：化学、化工、轻工、石油、环保、医药、农业等几乎所有学科领域。为信息科学、生命科学、材料科学、环境科学等新兴学科的发展作出了重要贡献。第11页,共62页，星期六，2024年，5月1.2色谱法的分类按流动相分气相色谱（GC）液相色谱（LC）超临界流体色谱（SFC）按机理分吸附色谱分配色谱离子交换色谱排阻色谱第12页,共62页，星期六，2024年，5月按固定相在支持体中的形状分柱色谱平板色谱纸色谱薄层色谱按分离效率分经典液相色谱高效液相色谱第13页,共62页，星期六，2024年，5月毛细管电色谱法

（CEC）色谱法GSC液相色谱法（LC）柱色谱法平面色谱法毛细管电泳法

（CE）LLCLSCSECIECBPC纸色谱法薄层色谱法

（TLC）LLCLLCLSC气相色谱法（GC）柱色谱法GLC超临界流体色谱法（SFC）第14页,共62页，星期六，2024年，5月1.3色谱法的特点与局限性1.特点1）选择性好2）效率高、速度快3）灵敏度高、样品用量少4）应用范围广2.局限性1）定性能力相对弱；2）定量时必须有标准品；3）有些物质如异构体、固体物质的分析能力较差。第15页,共62页，星期六，2024年，5月1.4色谱图和相关术语色谱过程

实现色谱操作的基本条件是必须具备相对运动的两相，固定相(stationaryphase)和流动相(mobilephase)。

色谱过程是组分的分子在流动相和固定相间多次“分配”的过程。第16页,共62页，星期六，2024年，5月

第17页,共62页，星期六，2024年，5月

1.色谱图（色谱流出曲线）是由检测器输出的电信号强度对时间作图所绘制的曲线，又称为色谱流出曲线。第18页,共62页，星期六，2024年，5月

峰峰高基线峰宽半峰宽峰面积标准偏差σ第19页,共62页，星期六，2024年，5月2.基线在实验操作条件下，色谱柱后没有样品组分流出时的流出曲线称为基线，稳定的基线应该是一条水平直线。3.峰高色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以（h）表示。第20页,共62页，星期六，2024年，5月

色谱流出曲线和色谱峰基线（a）峰高（h）信号进样空气峰ha色谱流出曲线色谱峰第21页,共62页，星期六，2024年，5月（四）保留值

1.死时间tM

不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间，它正比于色谱柱的空隙体积，如下图。信号进样tM第22页,共62页，星期六，2024年，5月

因为这种物质不被固定相吸附或溶解，故其流动速度将与流动相流动速度相近。测定流动相平均线速ū时，可用柱长L与tM的比值计算，即

ū=L/tM第23页,共62页，星期六，2024年，5月2.保留时间tR试样从进样到柱后出现峰极大点时所经过的时间，称为保留时间，如下图。信号进样tR第24页,共62页，星期六，2024年，5月3.调整保留时间tR´某组分的保留时间扣除死时间后，称为该组分的调整保留时间，即tR´=tR

tM

由于组分在色谱柱中的保留时间tR包含了组分随流动相通过柱子所需的时间和组分在固定相中滞留所须的时间，所以tR实际上是组分在固定相中保留的总时间。第25页,共62页，星期六，2024年，5月

保留时间是色谱法定性的基本依据，但同一组分的保留时间常受到流动相流速的影响，因此色谱工作者有时用保留体积来表示保留值。第26页,共62页，星期六，2024年，5月4.死体积V0

指色谱柱在填充后，柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和。当后两项很小可忽略不计时，死体积可由死时间与色谱柱出口的载气流速Fco（cm3·min-1）计算。

第27页,共62页，星期六，2024年，5月

V0=tMFco

式中Fco为扣除饱和水蒸气压并经温度校正的流速。仅适用于气相色谱，不适用于液相色谱。第28页,共62页，星期六，2024年，5月5.保留体积VR指从进样开始到被测组分在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相的体积。保留时间与保留体积关系：

VR=tRFco

第29页,共62页，星期六，2024年，5月6.调整保留体积VR

某组分的保留体积扣除死体积后，称为该组分的调整保留体积。

VR

=VR

V0=tR

Fco

第30页,共62页，星期六，2024年，5月7.相对保留值r2,1

某组分2的调整保留值与组分1的调整保留值之比，称为相对保留值。

r2,1=tR2

/tR1´=VR2

/VR1

由于相对保留值只与柱温及固定相性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关，因此，它在色谱法中，特别是在气相色谱法中，广泛用作定性的依据。第31页,共62页，星期六，2024年，5月

在定性分析中，通常固定一个色谱峰作为标准（s），然后再求其它峰（i）对这个峰的相对保留值，此时可用符号

表示，即

=tR(i)/tR

(s)

式中tR(i)为后出峰的调整保留时间，所以

总是大于1的。相对保留值往往可作为衡量固定相选择性的指标，又称选择因子。第32页,共62页，星期六，2024年，5月(五)区域宽度色谱峰的区域宽度是色谱流出曲线的重要参数之一，用于衡量柱效率及反映色谱操作条件的动力学因素。表示色谱峰区域宽度通常有三种方法。第33页,共62页，星期六，2024年，5月1.标准偏差

---即0.607倍峰高处色谱峰宽的一半。2.半峰宽Y1/2---即峰高一半处对应的峰宽。它与标准偏差的关系为

Y1/2=2.354

3.峰底宽度Y---即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上截距间的距离。它与标准偏差

的关系是Y=4

第34页,共62页，星期六，2024年，5月第35页,共62页，星期六，2024年，5月从色谱流出曲线中，可得许多重要信息：(i)根据色谱峰的个数，可以判断样品中所含组分的最少个数；(ii)根据色谱峰的保留值，可以进行定性分析；(iii)根据色谱峰的面积或峰高，可以进行定量分析；(iv)色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据；(v)色谱峰两峰间的距离，是评价固定相（或流动相）选择是否合适的依据。第36页,共62页，星期六，2024年，5月

色谱分析的目的是将样品中各组分彼此分离，组分要达到完全分离，两峰间的距离必须足够远，两峰间的距离是由组分在两相间的分配系数决定的，即与色谱过程的热力学性质有关。但是两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很宽，以致彼此重叠，还是不能分开。这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的，即与色谱过程的动力学性质有关。因此，要从热力学和动力学两方面来研究色谱行为。

第37页,共62页，星期六，2024年，5月关于保留值死时间(tM):无保留组分出峰时间保留时间(tR):调整保留时间(t’R):死体积(VM):保留体积(VR):

调整保留体积(V’R):第38页,共62页，星期六，2024年，5月1.5色谱现代发展及相关联用技术1.理论方面色谱理论的本质是研究色谱热力学、色谱动力学以及热力学与动力学有机结合来寻求色谱分离的最佳化途径。平衡理论、塔板理论、纵向扩散理论、速率理论；块状液膜模型、分子顶替模型、各种保留值预测理论，等等。第39页,共62页，星期六，2024年，5月2.新型固定相和检测器的研究（1）固定相手性固定相—手性化合物的分离分析固定相载体的研究：粒径均匀、高强度的高分子多孔微球制备技术一般仪器所用填料3~5m；超高液相色谱仪中所用填料1.7m；整体柱技术（棒柱）：将填料单体、引发剂、制孔剂混合后通过原位聚合或固化在柱管中形成的多孔结构的棒状整体式柱体。目的：提高柱效和重现性，实现快速分离分析。第40页,共62页，星期六，2024年，5月

（2）检测器紫外检测器；荧光检测器；电化学检测器；示差折光检测器等。蒸发光散射检测器——可用于不吸收紫外光的物质（糖类等）的检测；适合于测挥发性低于流动相得物质。

半导体荧光检测器——具有高灵敏度，检测限可优于紫外分光光度法2个数量级。第41页,共62页，星期六，2024年，5月2.技术方面1）超临界流体色谱（SFC）超临界流体：物质处于临界温度和临界压力以上，既不是液体，又不是气体，是一种单一相态的流体。但它兼有气体的低粘度、液体的高密度以及介于气、液之间较高的扩散系数等特性。第42页,共62页，星期六，2024年，5月

第43页,共62页，星期六，2024年，5月

2）多维色谱多维技术有GC-GC、LC-GC、LC-LC等多种组合。3）毛细管电动色谱（CEC）可以看成是高效液相色谱和毛细管区带电泳相结合的产物。第44页,共62页，星期六，2024年，5月

生物芯片GC-MS—MS(或LC-MS-MS)LC-GC-MS3.仪器方面全微机化控制和数据处理的多功能色谱仪器已成为主流产品。4.色谱专家系统第45页,共62页，星期六，2024年，5月高效液相色谱第46页,共62页，星期六，2024年，5月气相色谱仪第47页,共62页，星期六，2024年，5月

1.6中文工具书及国内外期刊1.中文工具书分析化学手册，分析仪器手册2.主要色谱期刊《色谱》；《分析化学》第48页,共62页，星期六，2024年，5月

《JournalofChromatography》（荷兰）2.777（B）《JournalofChromatographicScience》（美国）《Chromatographia》（德国）1.398《JournalofLiquidChromatography&RelatedTechniques》（美国）《JournalofSeparationScience》第49页,共62页，星期六，2024年，5月

《BiomedicalChromatography》（英国）1.639《AnalyticalChemistry》（美国）5.2《Electrophoresis》3.7《JournalofCapillaryElectrophoresis》《JournalofPharmaceutical&BiomedicalAnalysis》2.453

等等第50页,共62页，星期六，2024年，5月

3.在互联网上查阅色谱文献第51页,共62页，星期六，2024年，5月第52页,共62页，星期六，2024年，5月第53页,共62页，星期六，2024年，5月第54页,共62页，星期六，2024年，5月色