脂质体新剂型

关于脂质体新剂型Introduction

靶向给药系统(target-orienteddrugdeliverysystem,简称TODDS)又称靶向制剂

是借助载体、配体或抗体将药物通过局部给药、胃肠道或全身血液循环而选择性地浓集于靶组织、靶器官、靶细胞或细胞内结构的制剂。第2页,共72页，星期六，2024年，5月

一、TODDS的分类

1.从药物到达的部位，可分为三级：⑴第一级指到达特定的器官或组织；⑵第二级指到达器官或组织内的特定的细胞（如肿瘤细胞而不是正常细胞，肝细胞而不是Kupffer细胞）；⑶第三级指到达靶细胞内的特定的细胞器。第3页,共72页，星期六，2024年，5月

一、TODDS的分类

1.从药物到达的部位，可分为三级：⑴第一级指到达特定的器官或组织；⑵第二级指到达器官或组织内的特定的细胞（如肿瘤细胞而不是正常细胞，肝细胞而不是Kupffer细胞）；⑶第三级指到达靶细胞内的特定的细胞器。第4页,共72页，星期六，2024年，5月靶向制剂的设计1被动靶向即自然靶向，药物以微粒给药系统为载体(microparticlesdrugdeliverysystems)通过正常的生理过程运送至肝、脾、肺等器官第5页,共72页，星期六，2024年，5月

（一）被动靶向制剂迄今，研究最多的被动靶向给药制剂是

LiposomesMicrospheresMicro-emulsionsNanoparticlesTODDS分类介绍第6页,共72页，星期六，2024年，5月

被动靶向制剂经静脉注射后，在体内的分布首先取决于微粒的粒径大小。通常小于50nm的纳米囊与纳米球缓慢积集于骨髓；小于7μm时一般被肝、脾中的巨噬细胞摄取；大于7μm的微粒通常被肺的最小毛细血管床以机械滤过的方式截留，被单核白细胞摄取进入肺组织或肺气泡。

被动靶向制剂的体内靶向性TODDS分类介绍第7页,共72页，星期六，2024年，5月靶向制剂的设计2主动靶向是指表面经修饰后的药物微粒给药系统，不被单核吞噬系统识别其上连接有特殊的配体，使其能够与靶细胞的受体结合；第8页,共72页，星期六，2024年，5月脂质体Liposomes第9页,共72页，星期六，2024年，5月脂质体（liposomes）的概念最早是1965年被英国科学家Banghan等提出的。当磷脂分散在水中时形成多层囊泡，而且每一层均为脂质双分子层，各层之间被水相隔开。这种由脂质双分子层组成，内部为水相的闭合囊泡称之为脂质体。一、概述

Introductions图脂质体的示意图第10页,共72页，星期六，2024年，5月脂质体主要由磷脂和胆固醇组成。磷脂由一个亲水的头部和两个疏水的尾部组成。一、概述

Introductions常见磷脂的结构示意图第11页,共72页，星期六，2024年，5月载药脂质体的结构示意图

第12页,共72页，星期六，2024年，5月药物被脂质体包封后有以下特点：1．靶向性和淋巴定向性

2．长效性

3．细胞亲和性与组织相容性4．降低药物毒性5．提高药物稳定性一、概述

Introductions第13页,共72页，星期六，2024年，5月Enhancedpermeabilityandretention(EPR)effect正常组织中的微血管内皮间隙致密、结构完整,大分子和脂质颗粒不易透过血管壁,而实体瘤组织中血管丰富、血管壁间隙较宽、结构完整性差,造成大分子类物质和脂质颗粒具有选择性高通透性和滞留性,这种现象被称作实体瘤组织的高通透性和滞留效应,简称EPR效应。第14页,共72页，星期六，2024年，5月第15页,共72页，星期六，2024年，5月第16页,共72页，星期六，2024年，5月蛋白质的聚乙二醇化MethoxyPolyethyleneGlycol，mPEGVeroneseM.DrugDiscoveryToday.2005Nov;10(21)PEGylatedMoleculesFrankF.Davis1981第17页,共72页，星期六，2024年，5月

PEG-IFN-2b

1.5µg/kg浓度

干扰素a-2b(pg/mL)0204060801001201101001000IFN-2b

3MU140160180周一

周二

周三

周四

周五

周六

周日未检测到血清干扰素病毒重新出现hDatafromEASL2001:Schering-PloughResearchInstitute蛋白质的聚乙二醇化第18页,共72页，星期六，2024年，5月PEGconjugatesalreadyonthemarket腺苷脱氨酶天冬酰胺酶促红细胞生成素第19页,共72页，星期六，2024年，5月蛋白质的聚乙二醇化聚乙二醇化干扰素半衰期生物活性Schering-PloughCorporation,Wyssetal.,CurrentPharmaceuticalDesign,200240h30%第20页,共72页，星期六，2024年，5月Half-life↑&activity↓followingPEGylation第21页,共72页，星期六，2024年，5月Random&Site-specificPEGylation第22页,共72页，星期六，2024年，5月

脂质体在体内与细胞的作用过程:分吸附adsorption、脂交换lipidexchange、内吞endocytosis、融合fusion四个阶段。吸附是脂质体与细胞作用的开始，受粒子大小和表面电荷等因素影响；脂交换是脂质体的脂类与细胞膜上脂类发生交换；内吞作用是脂质体被作为外来异物吞噬，通过内吞，脂质体能特异地将药物浓集于起作用的细胞内；融合指脂质体的膜与细胞膜融合进入细胞内，然后经溶酶体消化释放药物。一、概述

Introductions第23页,共72页，星期六，2024年，5月第24页,共72页，星期六，2024年，5月1．中性磷脂磷磷脂酰胆碱phosphatidylcholine是最常见的中性磷脂。有天然和合成两种来源。与其它磷脂比较，它具有价格低、电中性、化学惰性等性质。合成的磷脂酰胆碱：二棕榈酰胆碱dipalmitoylphosphatidylcholine,DPPC二硬脂酰胆碱distearoylphosphatidylcholine,DSPC鞘磷脂sphingomyelin,SM磷脂酰乙醇胺phosphatidylethanolamine，PE）。二、制备脂质体的材料

Materialsforpreparationofliposomes第25页,共72页，星期六，2024年，5月第26页,共72页，星期六，2024年，5月2．负电荷磷脂负电荷磷脂又称为酸性磷脂。制备脂质体常用的负电荷脂质有：磷脂酸（phosphatidicacid,PA）；磷脂酰甘油（phosphatidylglycerol,PG）；磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol,PI）；磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine,PS）等。二、制备脂质体的材料

Materialsforpreparationofliposomes第27页,共72页，星期六，2024年，5月3．正电荷脂质正电荷脂质均为人工合成产品，目前常用的正电荷脂质有：硬脂酰胺（stearylamine,SA）；胆固醇衍生物等。正电荷脂质制备的脂质体在基因的传递系统中应用非常普遍。二、制备脂质体的材料

Materialsforpreparationofliposomes第28页,共72页，星期六，2024年，5月4．胆固醇cholesterol

胆固醇（Ch）是自然界膜中的另一类重要的组成成分。它是一种中性脂质，亦属于两亲性分子，但是亲油性大于亲水性。胆固醇的结构二、制备脂质体的材料

Materialsforpreparationofliposomes第29页,共72页，星期六，2024年，5月5．长循环膜材

长循环脂质体是指含有神经节苷脂GM1gangliosideGM1或聚乙二醇Polyethyleneglycol,PEG衍生物的脂质体。神经节苷脂GM1引入了唾液酸残基增强了膜的稳定性、明显减少了网状内皮系统细胞对脂质体的摄取，延长了脂质体的体内循环时间；极性的聚乙二醇基则增强了脂质体膜的亲水性，减少了血浆蛋白与脂质体膜的相互作用，阻止网状内皮系统细胞对脂质体的摄取，从而也延长了脂质体的体内循环时间。二、制备脂质体的材料

Materialsforpreparationofliposomes第30页,共72页，星期六，2024年，5月脂质体的制备方法很多，常用的有下列几种：1．薄膜法

Filmformingmethod该法最早由Bangham报道，这是最早而至今仍常用的方法。系将磷脂等膜材溶于适量的氯仿或其它有机溶剂，脂溶性药物可加在有机溶剂中，然后在减压旋转下除去溶剂，使脂质在器壁形成薄膜，加入含有水溶性药物的缓冲液，进行振摇，则可形成大多室脂质体（multilamellarvesicles,MLV），其粒径范围约1-5

m。然后可用各种机械方法分散薄膜法形成的类脂膜，形成MLV脂质体。三、制备脂质体的方法

Preparationofliposomes第31页,共72页，星期六，2024年，5月2．逆相蒸发法Reverse-phaseevaporation最初由Szoka提出。一般的制法系将磷脂等膜材溶于有机溶剂如氯仿、乙醚等，加入待包封药物的水溶液（水溶液:有机溶剂=1:3-1:6）进行短时超声，直至形成稳定的W／O型乳剂，减压蒸发有机溶剂，形成脂质体。用逆相蒸发法制备的脂质体一般为大单层脂质体，常称为REVs。本法特点是包封的药物量大，体积包封率可大于超声波分散法30倍，它适合于包封水溶性药物及大分子生物活性物质如各种抗生素、胰岛素、免疫球蛋白、碱性磷脂酶、核酸等。三、制备脂质体的方法

Preparationofliposomes第32页,共72页，星期六，2024年，5月典型脂质体制备过程称量脂材料，如

EPC/CHOL/PEG-DSPE=55/40/5mol/mol/mol将脂材料溶解蒸发形成脂膜水化形成粗脂质体挤压形成小脂质体（空白或载药脂质体）第33页,共72页，星期六，2024年，5月典型脂质体制备方法薄膜法又称干膜分散法即将脂质材料及脂溶性药的混合于有机溶剂中，通过氮气或减压除去有机溶剂，在容器底壁上形成脂质薄膜；然后将溶有药物的水溶液加到脂质薄膜上，室温下放置30min使脂质水化，然后在高于Tc振荡分散脂膜，类脂膜碎片吸水膨胀，形成大多室脂质体。经超声分散后可形成小单室脂质体。第34页,共72页，星期六，2024年，5月典型脂质体制备方法French压力制备脂质体（Frenchpressliposomes,FPL）超声制备脂质体的最大问题是生物材料遭受超声辐射，这样不仅脂质变性，而且包裹在脂质体内的大分子和其它敏感化合物也发生变化性。目前有几种温和方法使膜破碎和重建。其中之一是将形成的大脂质体放入French压力室，在很大的压力下挤压。这各方法产生直径30~80nm单层或寡层的脂质体。该法适于作为敏感大分子载体，其稳定性比超声制备的脂质体稳定性好。高压挤压对于重组稳定的膜蛋白也是非常有用的方法。French压力是根据其发明人之一命名的。最初设计用于植物细胞和细菌的的破碎。目前由SLM-AmincoInc制造,Urbana,Illinois61801，USA。French压力室的中央是压力室，由不诱钢材料制成。能持续耐受137824kPa甚至275684kPa压力，有不同大小的压力室，分别为小于4ml和40ml。第35页,共72页，星期六，2024年，5月典型脂质体制备方法

挤压制备脂质体（membraneextrusion）通过挤压使脂质体通过固定孔径的滤膜，脂质体粒径变小。该方法需要很低的压力，689kPa即可。过滤膜分两类，一类是用于除菌用膜，它的通道是弯曲的，这些通道的孔径由膜中纤维密度决定，由于通道的弯曲性质，当大于膜孔径的脂质体通过些膜时，膜孔很容易堵塞，脂质体不能到达另一面；另一类是聚碳酸酯膜（polycarbonatemembrane）,该膜的通道是直的并且大小相同，脂质体容易通过，即使脂质体直径略大于孔径也能通过。一般将脂质体原液稀释至12μmol/ml后再过膜，脂质体易通过孔径。脂质体加压通过孔时，其结构发生变化，根据所需脂质体的大小选择膜的孔径。第36页,共72页，星期六，2024年，5月3．主动包封法

Remoteloadingmethod主动包封法使得制备高包封率脂质体成为可能，从根本上改变了难以制备高包封率脂质体的局面。但是主动包封技术的应用与药物的结构密切相关，不能推广到任意结构的药物，因而受到了限制。主动包封法也称为遥控包封装载(remoteloading)技术，对于弱碱性的药物可采用pH梯度法、硫酸铵梯度法等，对于弱酸性的药物可采用醋酸钙梯度法等。三、制备脂质体的方法

Preparationofliposomes第37页,共72页，星期六，2024年，5月三、制备脂质体的方法

PreparationofliposomesPassiveloadingActiveloading第38页,共72页，星期六，2024年，5月Doxorubicin第39页,共72页，星期六，2024年，5月H+H+DDDH+DH+insideacidpHoudsideneutralpHH+第40页,共72页，星期六，2024年，5月pH梯度法包封阿霉素隐形脂质体的原理前提：（1）分子型药物易穿透脂膜；（2）离子型药物不易穿透脂膜。普通磷脂材料和PEG材料形成类脂薄膜用pH（如4）较低的枸橼酸盐缓冲液水化脂膜，形成脂质体挤压过膜处理使脂质体粒径变小，得空白脂质体混悬液调节脂质体膜外pH使呈弱碱性（如pH8）另外取盐酸阿霉素溶于枸橼酸盐缓冲液（pH8），得药物溶液将空白脂质体混悬液和药物溶液分别于一定温度水浴中（Tc以上）加热片刻，混合，于该水浴中放置10分钟，不时振摇，即得。这是因为盐酸阿霉素在碱性环境中为阿霉素分子存在，在Tc以上分子型更易穿透脂质体膜，进入脂质体内部后，由于内部呈酸性，又形成枸橼酸阿霉素，以离子型存在，不能再缓回到溶液中，从而包封入脂质体内部。该法可达到95%以上的包封率。第41页,共72页，星期六，2024年，5月高包封率：遥控装载—硫酸铵梯度法

包封隐形脂质体硫酸铵梯度法包封脂质体是根据化学平衡移动原理而设计的，空白脂质体包封阿霉素的前提是：（1）脂质体膜可透过分子型药物；（2）离子型化合物较少或几乎不透过脂膜；（3）硫酸阿霉素的溶度积<<盐酸阿霉素的溶度积。第42页,共72页，星期六，2024年，5月遥控装载—硫酸铵梯度法制备脂薄膜；用高浓度硫酸铵溶液使脂膜水化（hydration）；挤压使此混悬液分别通过不同孔径的核子打孔的聚碳酸酯微孔滤膜，较大粒径的脂质体被剪切、“粉碎”成较小粒径的脂质体，这样制备成了空白脂质体。通过透析法或凝胶色谱柱过滤后，除去脂质体囊泡外部的硫酸铵，从而使脂质体囊泡内、外部的硫酸铵浓度形成了浓度梯度差(如1000倍。分子型DOX—NH2可透过脂质体膜，则在脂质体膜内、外形成如下平衡，见下图。第43页,共72页，星期六，2024年，5月遥控装载—硫酸铵梯度法第44页,共72页，星期六，2024年，5月4．免疫脂质体制备法免疫脂质体immunoliposomes对靶细胞分子水平上的识别能力，取决于其表面所连接识别分子的特异性结合能力。当将癌细胞特异性单克隆抗体McAb结合到脂质体上，能选择性地杀伤癌细胞。抗体与脂质体结合方法有：（1）吸附法（2）脂质蛋白融合法（3）交联法三、制备脂质体的方法

Preparationofliposomes第45页,共72页，星期六，2024年，5月1．形态、粒径及其分布脂质体的形态为封闭的多层囊状或多层圆球。其粒径大小可用显微镜法测定小于2µm时须用扫描电镜或透射电镜。也可用电感应法(如Coulter计数器)光感应法(如粒度分布光度测定仪)激光散射法或激光粒度测定法测定脂质体粒径及其分布。四、脂质体的表征

Characterizationofliposomes第46页,共72页，星期六，2024年，5月第47页,共72页，星期六，2024年，5月扫描电子显微镜(SEM)分辨率:～5nm放大倍数:～×20,0000透射电子显微镜(TEM)分辨率:～0.2nm放大倍数:～×60,0000P9第48页,共72页，星期六，2024年，5月原子力显微镜(SPM)分辨率:<0.1nm放大倍数:>100,0000第49页,共72页，星期六，2024年，5月乳腺癌细胞红细胞大肠杆菌环状溴原子扫描隧道显微镜分辨率:～0.1埃（1/100nm）放大倍数:～3亿倍第50页,共72页，星期六，2024年，5月2．包封率和载药量的测定

对处于液态介质中的脂质体制剂，可通过适当的方法分离脂质体，分别测定介质和脂质体中的药量，按下式计算包封率：

包封率=[脂质体中的药量／(介质中的药量+脂质体中的药量)]×100％载药量是指脂质体内含药物的重量百分率，如用包封药物溶液体积的相对量表示，可称为体积包封率(entrappedvolume)，单位为L/mol类脂。分离脂质体可用柱色谱法、离心法和透析法等。四、脂质体的表征

Characterizationofliposomes第51页,共72页，星期六，2024年，5月3．渗漏率的测定脂质体不稳定性的主要表现为渗漏和聚集。渗漏率表示脂质体在液态介质中贮存期间包封率的变化，可由下式计算：渗漏率＝（贮藏一定时间后渗漏到介质中的药量/包封的药量）×100％4．药物体内分布的测定

通常