DB51T 3184-2024医用供体猪 基因鉴定通则

DB51本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定科学院•四川省人民医院、四川泰康医院、南京医科大学附属苏州医院、海南医学院第二附属医院、华爱迪眼科医院、四川省机械研究设计院（集团）有限公司、四川省实验动物学会医用猪专业委员王毅、杜嘉祥、陈刚、蒋子敬、窦科峰、杨恒钰、钟浩、姚晓明、庄医用供体猪基因鉴定通则本文件规定了医用供体猪基因鉴定的总体原则及鉴GB/T30989高通量基因测GB/T33681.1高通量基因测序样本预处理方法第1部分：动GB/T35537高通量基因测序结GB/T38477基因表达的测定基因修饰geneticmodif基因组结构变异genomestructuralv注：基因组结构变异包括长片段序列插入或删除、串联重复、染色体倒位、染色体内部或染色体之间的序列易位、高通量测序high-throughpu123455.1有效性评价样本DNA提取可选用符合要求的市售试剂盒进行提取，也可由实验室自配试剂进行提取。引物设判定目标基因的是否敲除，应将符合预期的条带回收，进行测序（见结果判定a)出现目标条带，则判定基因整合有效。检测方法迹法、免疫组化/免疫荧光、酶联免疫吸附技术、流式细胞术等方法进行检测。建议根据不同生产工艺选择合适的检测方法，蛋白免疫印迹法可作为基础方法选用，蛋白免疫印迹法检测及判定方法可参考蛋白免疫印迹法结果判定a)成像图片本底干净，能观察到转印膜均匀的轻微背景轮廓，目标条带清晰且不过曝，即可判b)基因整合类应有目标基因蛋白表达，敲除类应无目标基因蛋白表达。5.2遗传稳定性检测医用供体猪群体每代个体均应进行基因型鉴定和基因表达检测，方法见5.1，应连续监测3代以上。染色体结构变异预期基因片段插入、序列缺失、倒置、异位，则认为在医用脱靶检测使用Cas-OFFinder（CRISPRRGENTools()）或类似算法模型工息和基因组参考序列一致，则认为没有脱靶，反之则PERVhumanmembranecofactorproteintransgenic(hCD46-tg)humandecay-acceleratingfactortransgenic(hCD55-tg)humanmembraneinhibitorofreactivelysistransgenic(hCD59-tg)humancomplement-regulatoryproteinC1inhibitortransgenic(hC1-INH-tg)HLA-E/humanbeta2-microglobulintransgenic(HLA-E/B2M-humansignalregulatoryproteinalphatransgenic(hCD47-tg)humanCTLA4-Igtransgenic(hCTLA4-Ig-porcineCTLA4-Igtransgenic(pCTLA4-Ig-tg)humandominant-negativemutantclassIItransactivatortransgenhumanthrombomodulintransgenic(hTBM-tg)humanendothelialproteinCreceptortransgenic(hEPCR-tg)humantissuefactorpathwayinhibitortransgenic(hTFPI-tg)humanectonucleosidetriphosphatediphosphohydrolase-1transgenic(hCD39-tg)humanecto-5′-nucleotidasetransgenic(hCD73-tg)humantumournecrosisfactorα–inducedprotein3(TNFAIP3)humanhaemeoxygenase1trasolublehumanTNFRI-Fctransgenic(sh血液采集：使用紫色采血管，采集猪全血3mL～5mL。LEA29Y上游引物：5’-GTACCCACCGCCATACTAC2×酶缓冲液KODBuffer1×2注：反应体系中的各组分可根据不同最终反应体系进行区分，但是需保持所最后68℃延伸5min；反应完成后在4℃保存。制备1%的琼脂糖凝胶并加入染色剂，在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。将10检验过程中分别设阳性对照、阴性对照、空白对照。采用含有LEA29Y基因的质粒作为阳性对照，WT猪的DNA作为阴性对照，采用与模板等体积a)空白对照：无PCR扩增产物条带；在符合B.1.5的情况下，被检样品在573bp大小处可见PCR扩增条带则判为阳性，LEA29Y基因整合至猪基因组上；在573bp大小处未见PCR扩增条带利用LEA29Y蛋白与LEA29Y抗体的特异性结合，检测抗体酶标物或标记荧光来间接鉴定LEA29Y取适量猪胰腺组织，加入100μLRIPA裂解液，冰上裂解30min。获得胰腺组织蛋白液，取少量细胞裂解液测定蛋白浓度（可用BCA蛋白浓度测定将PVDF膜浸泡到甲醇中进行活化1min；将3张转膜用滤纸于转移缓冲液中浸泡5min；将转膜夹放于盛有1×转膜缓冲液的盘中，白板（阳极）在上，黑板（阴极）在下，由下向上依次放置1块海绵、2层滤纸、SDS-凝胶、PVDF膜、1层滤纸，注意PVDF膜和SDS-凝胶之间不应有气泡，最后合上转膜夹,将其放置于转膜槽中。转膜槽中加入4℃冰箱预冷30min的1×转膜液，加入冰袋，盖上转膜盖。然后将转膜槽放置于泡沫箱中，加入冰水混合物，以在180mA恒流（或90V恒压）条件下，转移时间为1.5h。转膜结束后，若Marker清晰可见，证明转膜将PVDF膜浸入封闭液（含5%脱脂奶粉的TBST）于平板摇床上摇动封闭1h｡将PVDF膜浸入含适当比例一抗的稀释液中，在室温下孵育1h｡取出PVDF膜，浸入TBST在摇床上洗涤4次，每次5min｡将PVDF膜浸入含适当比例二抗的稀释液中，在室温下孵育1h｡孵育完成后取出PVDF膜，浸入TBST在摇床上洗涤4次，每次5min｡达；若实验组与对照组均无目的条带，则蛋并冷冻，并储存在-70℃。用冰冻切片机作冰冻切片风干后用丙酮固定10min～15min。用0.3%过氧化氢甲醇溶液或1%盐酸酒精37℃作用30min。PBS漂洗3次，每次5min。5%小牛血清或1：10稀释的正常马血清，37℃湿盒中作用30min。加适当稀释的已知单抗或抗血清，37℃湿盒中作用1h后4℃过夜。PBS洗3次，每次5min。加适当稀释的第二抗体酶结合物，37℃盒作用1h。PBS洗3次，每次5min。新鲜配制的DAB溶液显色5min～10min后用PBS漂洗3次，每次5min。对照片本底清晰,背景无非特异着染,被检物呈黄至棕褐色着染,即可冰冻切片取出，室温放置使其干燥后，用冷丙酮于4℃固定10min。切片用0.01mol/LPBS清洗后加入1.2%双氧水作用30min，以除去非特异染色。0.01mol/LPBS清洗，洗3次，每次10min。加入荧光抗体IgG，室温育2h。0.01mol/LPBS清洗，洗3次，每次10min。用10mL注射器从猪的前腔静脉采集8mL全血。取6mL保存在促凝采血按照酶联免疫试剂盒所述操作步骤对待测试样(液)进行根据待测样本中目的蛋白的含量,选择一个合适的质控标准,以确定试验过程的操按照试剂盒说明书提供的计算方法,根据标准品质量浓度与吸光度变化关系绘制标准按照试剂盒说明书提供的计算方法,将待测样品吸光度代人B.所获得标准工作曲线,计算待测血液采集：使用紫色采血管，采集猪全血3mL～5mL。GGTA1下游引物：5’-GATCCTAATTGGGTTTGCTG2×酶缓冲液KODBuffer1×2最后68℃延伸5min；反应完成后在4℃保存。制备1%的琼脂糖凝胶并加入染