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饲料中牛羊源性成分检测实时荧光聚合酶链反应法Determinationofbovineandovinematerialinfeeds—2010-09-21发布2010-12-01实施I本标准遵照GB/T1.1—2009给出的规则起饲料中牛羊源性成分检测实时荧光聚合酶链反应法本方法的最低检出限为0.1%。GB/T20195动物饲料试样的制备26.1.1缓冲液I:50mmol/LTris-HCl和5%SDS,pH=8.0。称取Tris碱6.057g、SDS50g,pH至8.0,加水稀释至1000mL用浓盐酸(HCl)调pH至8.0,加水稀释至1000mL36.2.12×牛羊源性成分检测反应液6.2.2牛羊源性成分检测引物混合液含有扩增牛羊源性成分检测引物(序列详见表1)。引物浓度与使用的实时荧光PCR扩增仪有关，下游引物6.2.3牛羊源性成分检测探针混合液含有检测饲料中牛羊源性线粒体DNA的探针(序列详见表2)。探针浓度与使用的实时荧光PCR表2牛羊源性成分检测探针序列牛探针5'(FAM)-TGGACC/GGTTTTAGA/G羊探针5'(FAM)-TGGGCGATTTTAGA/GTGAGA-3'(M5'(FAM)-AGATGTCTTATTTAA7.8冰箱：温度，-20℃~4C。8.1DNA的提取底悬浮；加入蛋白酶K溶液(6.1.6)20μL,混匀。在65℃水浴约30min,其间混匀2次～3次；加入340μL缓冲液Ⅱ(6.1.2),充分颠倒混匀，65℃水6次～8次，此时可能会出现絮状沉淀；将所得溶液和絮状沉淀全部移入一个DNA吸附柱内(吸附柱放液Ⅲ(6.1.3)(使用前请按照缓冲液Ⅲ+无水乙醇=13+17的比例加入无水乙醇),12000r/min离心无水乙醇=1+4的比例加入无水乙醇),12000r/min离心30s,倒掉废液，将吸附柱放入收集管中；向4吸附柱内加入500μL漂洗液(6.1.4),12000r/mr/min离心2min,倒掉废液。将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μL～200μL洗脱缓冲液TE(6.1.5),室温放置约5min,12000r/min离心2min;该DNA提取溶液于一20℃保存。8.2试样中DNA浓度和纯度的测定将提取的DNA溶液(8.1)用双蒸水进行适当稀释，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计在260N——核酸稀释倍数。8.3实时荧光PCR检测8.4实时荧光PCR循环条件实时荧光PCR循环结束后，由荧光定量PCR仪自动生成分析结果报告，以C,平均值表述实验结空白对照无C₂值并且无扩增曲线，阴性对照无C.值并且无扩增曲线，0.1%的阳性对照出现典

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