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N水稻细菌性条斑病菌检疫检测与鉴定方法2012-12-24发布2013-03-01实施中华人民共和国农业部发布I1无水磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)、无水磷酸氢二钾(K₂HPO₄)、无水磷酸二氢钾(KH₂PO₄)、碳酸钠(Na₂CO₃)、碳酸氢钠(NaHCO₃)、氯化钠(NaCl)、氯化钾(KCl)、氯化镁(MgCl₂)、无水亚硫酸钠症状进行比较(见附录B),符合典型症状的可进行症状鉴定。如发现疑似症状，可采ELISA检测以及PCR检测。在无菌条件下选取疑似症状叶片病健交界处组织约(3mm~5mm)×(3mm~5mm),用75%乙醇表面消毒15s,无菌水清洗2次~3次后放入0.2mL无菌水中，用灭菌玻璃棒研碎，在室温下浸泡10min～~30min。将悬浮液在NBY培养基平板上划线，重复3个~5个平板，(27±2)℃培养3d~5d,观挑取少量分离到的病原菌配制成悬浮液，进行革兰氏染色法染色或3%KOH溶解试验(参见附录7.2.4致病性鉴定感病水稻品种叶片中部，每张叶片针刺2个点～3个点，每株接种2片叶～3片叶，接种10株。接种植株套袋保湿24h,12h光照/黑暗的循环条件下30℃培养，接种48h~72h后观察并记录水7.3ELISA检测8结果判定和报告在阴性对照OD值≤0.1,且阳性对照OD值大于阴性对照OD值2倍的前提下，样品孔OD值大于34调整pH到7.4。并调整pH到7.4。A.4PCR5NaN₃,调节pH至7.4,加蒸馏水至1000mL。取牛肉汁8.0g,酵母膏2.0g,K₂HPO₄2.0g,KH₂PO₄0.5g,葡萄糖2.5g,琼脂15g,水1L,灭菌6thomonas),英文名BacterialleafStreakofRice。病菌最适生长温度25℃~28℃,生长温限别见表B.1。水稻细菌性条斑病水稻白叶枯病叶面任何部位从叶尖或叶缘开始白色条斑，病健组织界线明显，分界处成波纹状半透明不透明发病时期水稻整个生育期均可发病78将田间采回的植株叶片先用无菌水洗2次，再用75%酒精表面消毒15s。将样品剪成20mm²小取样品种子20g,用小型粉碎机粉碎10s,使谷壳破裂。将样品用样品提取液25mL包被液浸泡10D.2包被D.2.1加样D.2.2封闭将酶联板置于37℃的恒温箱中至酶联板反应孔中的样品完全干燥。在每个反应孔中加入200μLD.2.3洗板D.3结合抗体参照D.2.3洗板方法进行。D.4结合酶标抗体每孔加入100pL按照使用说明书要求稀释的酶标抗体。孵育方法同DD.4.2洗板参照D.2.3洗板方法进行。9见表E.1。53120mg/mL牛血清白蛋白(BSA)121～4—-阳性样品；

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