感受态细胞及其制备高二下学期生物人教版选择性必修3

感受态细胞及其制备2019版高中生物学选择性必修三提到，在基因工程操作中，常用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌应用最为广泛。研究人员一般先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中：能吸收周围环境中DNA分子的生理状态的细胞称为“感受态细胞”感受态细胞(petentcell)是指受体(宿主)细胞最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态。主要原理是通过处理使细胞的通透性变大(细胞膜表面出现一些孔洞)，便于外源基因或载体进入感受态细胞，在感受态细胞中得到复制扩增，得到多个拷贝的外源基因或载体。对于感受态细胞，以下是一些基本的要求：不含质粒：这样可以避免与引入的DNA发生不必要的重组或整合；容易转化：通常是G细菌，因为其细胞壁较薄，更容易被DNA穿透营养条件适中：不是苛养菌，以确保细胞在转化过程中的生存。特点是：①细胞表面暴露出一些可接受外来DNA的位点（以溶菌酶处理，可促使受体细胞的接受位点充分暴露）；②细胞膜通透性增加（用钙离子处理，可使膜通透性增加，使DNA直接穿过质膜进入细胞）；③受体细胞的修饰酶活性最高，而限制酶活性最低，使转入的DNA分子不易被切除或破坏；④受体细胞本身处于非生长繁殖阶段（即受体细胞染色体相对稳定）；⑤不存在载体的筛选基因，多采用限制酶阴性、修饰酶阳性的大肠杆菌作为受体细胞。感受态细胞的制备方法：其中主要有两种最为常用，那就是电转法和氯化钙法。1、电转化电转法也称电转化法，依靠电击，利用瞬间高压使细胞膜不稳定，在细胞上打孔，促使DNA等大分子进入细菌。2、氯化钙法化学感受态细胞经氯化钙处理，促进质粒DNA黏附于感受态细胞膜上。将感受态细胞通过水浴热激，使细胞膜孔打开，从而质粒可以进入。氯化钙法制备及转化的基本步骤：1、受体菌的培养从LB平板上挑取新活化的E.coliDH5α单菌落,接种于35mlLB液体培养基中，37℃下振荡培养12小时左右，直至对数生长后期。将该菌悬液以1:1001:50的比例接种于100mlLB液体培养基中，37℃振荡培养23小时至OD600＝0.4左右。2、感受态细胞的制备(CaCl2法)将培养液转入离心管中，冰上放置10分钟，然后于4℃下3000g离心10分钟。弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2溶液10ml轻轻悬浮细胞，冰上放置1530分钟后，4℃下3000g离心10分钟。弃去上清，加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟，即成感受态细胞悬液。感受态细胞分装成200μl的小份，贮存于70℃可保存半年。3、转化从70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上。加入pBS质粒DNA溶液(含量不超过50ng,体积不超过10μl)，轻轻摇匀，冰上放置30分钟后。42℃水浴中热击90秒或37℃水浴5分钟，热击后迅速置于冰上冷却35分钟。向管中加入1mlLB液体培养基(不含Amp)，混匀后37℃振荡培养1小时,使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr)。将上述菌液摇匀后取100μl涂布于含Amp的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养1624小时。同时做两个对照:对照组1:以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。对照组2:以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，但涂板时只取5μl菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。4、计算转化率统计每个培养皿中的菌落数。转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积转化频率（转化子数／每mg质粒DNA）＝转化子总数／质粒DNA加入量(mg)感受态细胞总数＝对照组２菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数感受态细胞制备及转化中的影响因素：1.细胞的生长状态和密度从70℃或20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个左右为佳。对于TG1菌株，当OD600为0.5时，细胞密度在5×107个/ml左右。受体细胞一般应是限制修饰系统缺陷的突变株，不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积10%15%的无菌甘油或70℃保存。2.质粒DNA的质量和浓度用于转化的质粒DNA应为超螺旋态的，转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比。加入的外源DNA量过多或体积过大会使转化率下降。DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%。质粒分子量过大的转化效率低，大于30kb的重组质粒难以进行转化。重组DNA分子的构型与转化效率密切相关，环状重组质粒的转化率较线性重组质粒高10~100倍。3.试剂的质量所用的CaCl2等试剂应是最高纯度的，并用最纯净的水配制，最好分装保存于4℃。4.防止杂菌和杂DNA的污染操作过