DB15T+3551-2024呼伦贝尔羊种质资源冷冻保存技术规程

ICS65.020.30CCSICS65.020.30CCSB44内蒙古自治区地方标准DB15/T3551—2024呼伦贝尔羊种质资源冷冻保存技术规程TechnicalcodeofgermplasmresourcescryopreservationonHulunbeiersheep2024-07-152024-07-152024-08-15内蒙古自治区市场监督管理局发布DB15/T3551—2024前 言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC19）归口。IIDB15/T3551—2024呼伦贝尔羊种质资源冷冻保存技术规程范围本文件适用于呼伦贝尔羊精液、卵母细胞和胚胎的冷冻保存。（GB/T26613呼伦贝尔羊NY/T1674牛羊胚胎质量检测技术规程DB15/T1769绵羊冷冻精液DB15/T3401奶绵羊胚胎冷冻解冻技术规程3术语和定义3术语和定义GB/T26613界定的以及下列术语和定义适用于本文件。开放式拉长细管openpulledstraw卵母细胞和胚胎玻璃化冷冻保存的容器。胚胎保存液holding用于胚胎体外发育的一种商品化溶液。4缩略语下列缩略语适用于本文件。BSA：牛血清白蛋白（BovineSerumAlbumin）COCs：卵丘卵母细胞复合体（Cumulus-OocyteComplexes）DMSO：二甲基亚砜（DimethylSulfoxide）EG：乙二醇（EthyleneGlycol）FBS：胎牛血清（FetalBovineSerum）OPS：开放式拉长细管（OpenPulledStraw）1DB15/T3551—2024PBS：磷酸盐缓冲液（PhosphateBufferedSolution）TS：玻璃化解冻液（ThawingSolution）VS：玻璃化冷冻液（VitrifiedSolution）5精液冷冻保存按照附录A中表A.1规定的配方配制。标记按照DB15/T1769的规定执行。精子活力≥70%、密度≥0.8×109个/mL、畸形率≤15%，颜色为乳白色。原精液用PBS稀释5倍，缓慢搅拌，孵育5min，以600rpm离心10min，移除上清液。稀释和平衡I2×108/4℃冰箱平衡2hII1×108个/毫升，再平衡1.5h。装管在4℃条件下，将精液分装到0.25mL细管中，另一端封口。冷冻利用程序冷冻仪，在4℃～-35℃温区，设置6℃/min的降温速率；在-35℃～-100℃的温区，设置20℃/min的降温速率，然后投入液氮。将液氮倒入深度50cm以上的泡沫箱预冷10min，细管铺放在支架后放入泡沫箱，支架平面距离液氮面4cm，熏蒸7min，然后投入液氮。冻精细管以25支或50支包装单位投入液氮罐。取出冻精细管，室温空气浴5s，然后放置于40℃水浴10s取出，无菌纸巾擦干备用。6卵母细胞冷冻保存2DB15/T3551—2024OPS法。324按照附录A中表A.2规定的配方配制。冷冻OPS将0.25mL细管加热变软后拉成为管壁内径为0.2mm，管壁厚0.02mm的OPS管，冷却后用手术刀片在其细端切开，细端长度约2cm。2530min，100μL～200μL的VS1和VS2mlOPS6.4.3冷冻6.4.3冷冻将卵母细胞在VS1液中平衡30s，再移入VS2液中平衡不超过25s，将多枚卵母细胞及少量VS2吸入OPS中，投入液氮保存。解冻准备25℃至少预热30min2mlTS1200μLTS1、TS2、TS33710min。解冻OST1mi，TS25TS353～50.5h～2h7胚胎冷冻保存冷冻方法程序冷冻仪法。胚胎选择选择1、2级桑葚胚至扩张囊胚，胚胎质量鉴定按照NY/T1674的规定执行。3DB15/T3551—2024溶液配置按照附录A中表A.3规定的配方配制。标记按照DB15/T3401的规定执行。胚胎回收回收到装有胚胎保存液并编号的平皿中。洗涤胚胎在胚胎保存液滴中洗4次，放入做好标记的平皿中，30min内必须开始冷冻。平衡胚胎在S1和S2液中平衡5min，在1.5M乙二醇中平衡10min。冷冻按照DB15/T3401的规定执行。贮存将细管装入相应的拇指管内，放入液氮罐中保存。解冻胚胎细管从液氮中取出，空气浴2s～3s后，放入32℃水浴10s。把胚胎放入T液中平衡5min，然后把胚胎移入胚胎保存液平衡5min，并洗3次，备用。4A.3胚胎冷冻保存溶液配方见表A.3。表A.3胚胎冷冻保存溶液配方A.3胚胎冷冻保存溶液配方见表A.3。表A.3胚胎冷冻保存溶液配方5附录A（资料性）种质资源冷冻保存溶液配方A.1。表A.1精液冷冻保存溶液配方种质资源溶液名称配方精液冷冻保存稀释液I液超纯水80ml、葡萄糖2.80g、柠檬酸钠2.0g、卵黄20ml、青霉素10万单位、链霉素10万单位冷冻保存稀释液II液I液45ml、甘油5mlA.2。表A.2卵母细胞冷冻保存溶液配方种质资源溶液名称配方卵母细胞基础液mPBS液DPBS100ml、3.6mg丙酮酸钠、0.1g葡萄糖、0.3g牛血清白蛋白FS液含有0.3g/ml聚蔗糖、0.17g/ml蔗糖的mPBS冷冻液VS1含7.5胎牛血清的mPBSVS2含牛血清的mPBS解冻液TS1含0.34g/ml蔗糖的mPBSTS2含0.17g/ml蔗糖的mPBSTS3含0.085g/ml蔗糖的mPBS卵母细胞培养液含5%（v/v）